HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法技术

本发明专利技术建立HPLC法同时测定管萼山豆根中苦参碱，金雀花碱、氧化苦参碱、N‑甲酰基金雀花碱4种生物碱的方法，采用Boston Green ODS PC

Determination of four alkaloids in the roots of guanyushan by HPLC

【技术实现步骤摘要】
HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法所属
本专利技术涉及一种HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法，属于检测

技术介绍
管萼山豆根(EuchrestatubulosaDunn)是豆科山豆根属植物，又名鄂豆根、胡豆莲、豆根、鸦片七(湘西地区)，民间习用根茎，利咽喉，治腹胀、腹痛，主要产自湖北西北、湖南、四川。山豆根属植物性苦寒，具有较强的清热、镇痛、消炎和抗癌等作用，对治疗咽喉痛、牙痛、胃腹痛、毒虫咬伤等有良好疗效。在武陵山区的土家族将管萼山豆根誉“信誉极高的民族药”，同属植物山豆根(E.japonicaHook.f.exRegel)在日本民间用于抗癌、抗心律不齐、消炎和治疗溃疡。尹玉琴等研究发现，管萼山豆根总生物碱也具有镇静、镇痛及降温等中枢系统抑制作用，目前尚未见有关管萼山豆根中生物碱类化合物的含量测定报道，我们已经从管萼山豆根茎中分离得到苦参碱，金雀花碱、氧化苦参碱、N-甲酰基金雀花碱。
技术实现思路
本专利技术通过建立HPLC法同时测定4种生物碱的含量，为今后该药材及同属药材选择和评价提供依据。一种HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法，包括以下步骤：(1)生物碱提取：管萼山豆根根、茎、叶于50℃烘干后粉碎,过30目筛，加入纯净水，其中加入水量L与管萼山豆根重量kg比1:25-350，超声20-40min后，75-85℃回流提取2h，提取后滤纸过滤1次，加水定容至1500mL，作为生物碱样品溶液；(2)HPLC检测：色谱柱为BostonGreenODSPC18(4.6*250mm，5μm)柱，流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长220nm，进样量10μL，其中乙腈与0.2％磷酸水溶液的体积L比为0.04:0.76。所述0.2％磷酸水溶液中优选含有0.01％三乙胺的0.2％磷酸水溶液。技术效果1、本专利技术方法可以快速检测管萼山豆根根、茎、叶中苦参碱，金雀花碱、氧化苦参碱、N-甲酰基金雀花碱这四种生物碱。2、节省时间、提高效率，为今后该药材及同属药材选择和评价提供依据。附图说明图1对照品及样品HPLC：a—对照品图谱；b—样品图谱(茎的水提物)；0溶剂峰，1金雀花碱，2苦参碱，3氧化苦参碱，4N-甲酰基金雀花碱；图2苦参碱的含量对比图；图3氧化苦参碱的含量对比图；图4金雀花碱的含量对比图；图5N-甲酰基-金雀花碱的含量对比图；图6管萼山豆根根、茎、叶中几种生物碱的含量对比图。具体实施方式下面，本专利技术将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例11供试溶液的制备分别称取管萼山豆根根、茎、叶样品各9份，每份5g，分别加入纯净水，95％乙醇，pH＝2的稀酸水(各组平行3份)，液料比1:30，超声20min后，80℃回流提取2h。提取后过滤，加水定容至150mL(酸水提取液预先用氨水调节碱性pH＝7)，分别取各样品适量，稀释10倍，作为供试品溶液。2对照品溶液的制备分别称取4种生物碱1～4对照品:5.5、5.2、5.4与5.4mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，配制成0.500mg/mL的对照品储备溶液。分别精密量取各储备液适量，配成混合对照品溶液(a)：苦参碱，、金雀花碱、氧化苦参碱、N–甲酰基金雀花碱浓度为0.1mg/mL，用于条件摸索。预实验表明，供试液中苦参碱浓度在0.001～0.01mg/mL之间，其它3种在0.01～0.1mg/mL之间，因此绘制标准曲线所用混合对照品溶液(b)苦参碱浓度调整为0.01mg/mL，其它3种生物碱浓度为0.1mg/mL。分别吸取混合对照品溶液(b)1、2、4、6、8mL置于10mL容量瓶，加甲醇定容至刻度线，配置成不同浓度梯度的对照品溶液。3色谱条件通过多次调整流动相比例和峰形观察，HPLC确定同时测定4种生物碱的条件为：BostonGreenODSPC18(4.6*250mm，5μm)柱，流动相为乙腈-0.2％磷酸(含0.01％三乙胺)(比例：0.04:0.76)，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长220nm，进样量10μL。混合对照品溶液(a)HPLC图，样品图(以管萼山豆根茎的水提物图谱为例)见图1，结果表明该方法的系统适用性良好。4含量测定方法的建立4.1线性范围考察采用2.3项下的色谱条件，相应对照品的浓度(mg/mL)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，进行线性回归分析，结果见表1。相关系数(r)均大于0.999，表明4种生物碱在相应质量浓度范围内线性关系良好。表1各成分的回归方程，相关系数(r)及线性范围Table1Linearregressionequations,corrrelationcoefficientsandlinearrangesofeveryconstituents4.2精密度试验[8]取混合对照品溶液(b)，按2.3项下色谱条件重复进样6次，计算得峰面积的RSD分别为1.87％、1.51％、2.38％、2.12％，表明精密度良好。4.3重复性试验[9]精密取管萼山豆根的茎样品6份，按2.1项下的方法制备管萼山豆根茎的水提物供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，分别计算4种生物碱的平均质量分数和RSD，分别为：2.38％、1.58％、2.01％、0.93％，表明该方法重复性较好。4.4稳定性试验取管萼山豆根茎的水提物供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、6、9、12h进样测定，分别记录4种生物碱的峰面积，求平均值并计算得RSD，分别为：1.01％、1.35％、1.61％、2.19％，表明样品在12h内稳定。4.5加样回收率试验[10]精密量取4种生物碱含量已知的管萼山豆根茎样品，准确添加一定浓度的对照品溶液，按样品制备方法操作，测定并计算平均回收率和RSD值，4种生物碱的平均回收率分别为：99.09％、99.50％、98.83％、99.44％，RSD小于2.1％。5生物碱组分的含量测定及结果分析按2.3项下的HPLC的方法检测管萼山豆根的根、茎、叶中生物碱，根据标准曲线计算原料中生物碱的含量，并比较不同提取方法的提取率。5.1各生物碱在根、茎、叶中含量及提取方法对比各生物碱组分在不营养同器官中的含量及提取方法对比如图2～5。由图2可以看出，叶中苦参碱的含量最高，约为3.4mg/g，其次是根和茎，分别为2.0mg/g与1.6mg/g。比较三种溶剂提取效果可以看出，在根、茎、叶中，水煎法均最有利于苦参碱的浸出。由图3可以看出，根中氧化苦参碱含量最高，约为22.67mg/g，其次是茎(11.93mg/g)，叶中含量最少，仅3.52mg/g。三种提取溶剂提取对氧化苦参碱提取率的浸出影响不明显，酸水提取有利于根中氧化苦参碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法，包括以下步骤：/n(1)生物碱提取：管萼山豆根根、茎、叶于50℃烘干后粉碎,过30目筛，加入纯净水，其中加入水量L与管萼山豆根重量kg比1:25-350，超声20-40min后，75-85℃回流提取2h，提取后滤纸过滤1次，加水定容至1500mL，作为生物碱样品溶液；/n(2)HPLC检测：色谱柱为Boston Green ODS PC

【技术特征摘要】
1.一种HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法，包括以下步骤：
(1)生物碱提取：管萼山豆根根、茎、叶于50℃烘干后粉碎,过30目筛，加入纯净水，其中加入水量L与管萼山豆根重量kg比1:25-350，超声20-40min后，75-85℃回流提取2h，提取后滤纸过滤1次，加水定容至1500mL，作为生物碱样品溶液；
(2)HP...

【专利技术属性】
技术研发人员：董爱文，姚姝凤，成江，
申请(专利权)人：长沙湘资生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43