一种具翼烟草单染色体鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子萌发，待根长至0.5～1cm时，于上午9:00‑11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α‑溴奈溶液室温预处理，清洗后，置入蒸馏水前低渗，用纤维素‑果胶酶混合酶液处理，制备染色体制片，饱和醋酸地衣红染液染色；(2)然后对前述染色体制片进行核型分析、异染色质带谱分析和45s和5s rDNA染色体图谱分析；(3)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色体位点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。

A single chromosome identification method of winged tobacco

【技术实现步骤摘要】
一种具翼烟草单染色体鉴定方法
本专利技术涉及具翼烟草单染色体鉴定方法，属于生物

技术介绍
植物根尖细胞有丝分裂及染色体制片技术：植物生长旺盛的分生组织如根尖、茎尖、幼叶等都在进行着有丝分裂。取这些组织为材料，经过固定后迅速杀死细胞，并使细胞内的物质和生活状态得以保持，再经过解离、染色、压片等过程，可以迅速地将细胞分散附着于载玻片和盖玻片之间，在显微镜下就可以看到大量处于有丝分裂各个时期的细胞，并进行染色体观察。分裂中期，各染色体的着丝粒排列在赤道面上，两臂伸向赤道面的两旁。纺锤体完全形成，其一端与染色体的着丝粒相连接，另一端集中于细胞的极处。中期染色体高度浓缩，具有各物种染色体的典型形态，是染色体观察的最好时期。染色体核型分析：染色体核型分析是以分裂中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，进行分析、比较、排序和编号。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。染色体带型分析：染色体带型，染色体经过特殊处理并用特定染料染色后，在光学显微镜下可见其臂上显示不同深浅颜色的条纹，此称为染色体带。各号染色体带的形态称为带型。对每种染色方法，每条染色体显示的带纹分布是一定的。通过染色体的分带技术，可以使染色体组型分析更为准确。主要的显带技术有G带(Giemsa显带)、Q显带(奎丫因显带)、R显带(逆转显带)、C显带(着丝粒显带)、前期显带(高分辨技术)。染色体带型是鉴别染色体的重要依据。通过分带机理的研究，可获得染色体在成分、结构、行为和功能等方面的许多信息。染色体分带的研究工作始于60年代末。染色体分带技术就是经理化因素处理后，用染色法使染色体呈现特定的深浅不同的带纹的方法，又称显带技术。而用一般细胞学染色法，染色体的着色是均匀的。经分带技术处理后，在染色体上所呈现的带纹反映了染色体的固有结构，可显示不同物种染色体的差异或同一物种不同染色体的差异。现有的鉴定烟草单染色体的方法：运用核型分析技术鉴定烟草单染色体：取种子在室温25℃条件下，摇床上水培振荡萌发，待幼根长至1～3mm时，转移进行预处理，一般在材料进行有丝分裂高峰期前2～3h，即8:30～11:30之间处理。预处理液一般有5种：①对二氯苯饱和液；②0.2％的秋水仙素；③0.002mol/L浓度的8-羟基喹啉溶液；④5％的风油精溶液；⑤20％的风油精溶液。预处理时间均为2h，温度20～25℃。弃处理液后，用乙醇、冰乙酸(3:1)固定材料24h，在转移至70％酒精溶液中，于0～4℃条件下储存备用。制片材料取根尖分生组织部分，用60℃1mol/LHCl恒温解离4～8min，常规压片法制片，镜检。根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，进行分析、比较、排序和编号。由于烟草染色体微小，细胞壁难以充分解离，上述技术难以得到分裂相多、分散度高的制片；染色体微小且同源染色体间形态差异不明显，仅从形态特征进行区分，难以准确鉴定单染色体。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种具翼烟草单染色体鉴定方法，准确鉴定具翼烟草单染色体，为具翼烟草的单染色体分离及其体外克隆提供技术。同时，为其他具有微小染色体的植物单染色体鉴定提供技术参考。本专利技术的技术方案是：一种具翼烟草单染色体鉴定方法，包含以下步骤：(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子萌发，待根长至0.5～1cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理，固定液固定过夜，清洗后，置入蒸馏水前低渗，用纤维素-果胶酶混合酶液处理，置入蒸馏水后低渗，制备染色体制片，饱和醋酸地衣红染液染色，光学显微镜检查染色体分散良好的细胞相；(2)然后对前述染色体制片进行核型分析、异染色质带谱分析和45s和5srDNA染色体图谱分析；(3)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色体位点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。所述的核型分析具体为：①测量：运用图像处理软件，测出每条染色体的长度，确定着丝粒位置，测出每条染色体的长臂、短臂，计算出着丝粒指数；②随体：通过目测确定每条染色体是否具有随体；③配对和排序：基于每条染色体的染色体全长、长/短臂的长度、着丝粒指数、以及是否具有随体等特征，将染色体两两配对，并按染色体全长递减排序。所述的异染色质带谱分析具体为：①图像增强：经醋酸地衣红染液染色后的染色体显示出异染色质带，经图像处理软件增强对比度后，染色体更加清晰显示出异染色质带；②带谱分析：检查每条染色体的异染色质带谱情况，记录每条染色体显带数量和位置，获得每对同源染色体的异染色质带谱特征。所述的45s和5srDNA染色体图谱分析具体为：①探针标记：用缺刻平移方法进行探针标记，45SrDNA探针用地高辛标记，5SrDNA探针用生物素标记；②杂交液的配制：每张染色体制片配制30-40μL杂交液，待用；③染色体变性及杂交：将染色体制片置于80℃变性液中变性，在-20℃下依次用75％、95％和100％的梯度酒精脱水，气干后，滴加杂交液，于保湿皿中37℃杂交12-48h；④原位杂交信号的荧光检测：杂交后的染色体制片经2×SSC在室温及37℃各洗10min，1×PBS室温洗1次；地高辛标记的探针第一步加入羊抗地高辛抗体,温育后用1×PBS温室洗，第二步加入兔抗羊地高辛偶联物,温育和洗脱同第一步；生物素标记的探针第一步加入链亲和素-Cy3,温育和洗脱与地高辛检测相同，再加入生物素化链抗亲和素，温育和洗脱同第一步；⑤图像检测及分析：染色体制片用加入抗淬灭剂Vectorshield的5mg/LDAPI复染，荧光原位杂交信号观察由荧光显微镜完成，CCD照相装置俘获图像，检查记录每条染色体的45S和5SrDNA图谱的数量和位置，获得每对同源染色体45S和5SrDNA的图谱特征。所述的杂交液，含50％的去离子甲酰胺，10％的硫酸葡聚糖，2×SSC，50mg/LssDNA，2mg/L的探针DNA,75℃变性5min。本专利技术的有益效果：(1)采用去壁低渗法获得的具翼烟草染色体制片，中期分裂相多、分散度高，中期染色体清晰；(2)采用饱和醋酸地衣红染液进行具翼烟草染色体染色，清晰显示异染色质带；(3)运用双色荧光原位杂交技术成功完成具翼烟草45S和5SrDNA染色体物理定位；(4)综合运用核型分析、异染色质带谱分析与45S和5SrDNA作图结果，准确鉴定具翼烟草9对同源染色体。附图说明图1为具翼烟草根尖有丝分裂中期染色体(A)及其核型配对(B)；图2为具翼烟草中期染色体醋酸地衣红染色(A)、染色体配对(B)及异染色质带谱分析(C)；图3为具翼烟草45S和5SrDNA染色体定位(A)及单染色体鉴定(B)；图4为传统的技术进行的具翼烟草染色体核型分析结果。具体实施方式具翼烟草单染色体分离鉴定方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子萌发，待根长至0.5～1cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理，固定液固定过夜，清洗后，置入蒸馏水前低渗，用纤维素-果胶酶混合酶液处理，置入蒸馏水后低渗，制备染色体制片，饱和醋酸地衣红染液染色，光学显微镜检查染色体分散良好的细胞相；(2)然后对前述染色体制片进行核型分析、异染色质带谱分析和45s和5s rDNA染色体图谱分析；(3)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色体位点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。/n

【技术特征摘要】
1.一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)染色体标本制备：具翼烟草成熟饱满种子萌发，待根长至0.5～1cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理，固定液固定过夜，清洗后，置入蒸馏水前低渗，用纤维素-果胶酶混合酶液处理，置入蒸馏水后低渗，制备染色体制片，饱和醋酸地衣红染液染色，光学显微镜检查染色体分散良好的细胞相；(2)然后对前述染色体制片进行核型分析、异染色质带谱分析和45s和5srDNA染色体图谱分析；(3)单染色体鉴定：对比分析具翼烟草每条同源染色体的核型分析结果、异染色质带谱与45S和5SrDNA染色体位点特征，完成具翼烟草染色体组每条单染色体的准确鉴定。


2.根据权利要求1所述的一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：所述的核型分析具体为：①测量：运用图像处理软件，测出每条染色体的长度，确定着丝粒位置，测出每条染色体的长臂、短臂，计算出着丝粒指数；②随体：通过目测确定每条染色体是否具有随体；③配对和排序：基于每条染色体的染色体全长、长/短臂的长度、着丝粒指数、以及是否具有随体等特征，将染色体两两配对，并按染色体全长递减排序。


3.根据权利要求1所述的一种具翼烟草单染色体鉴定方法，其特征在于：所述的异染色质带谱分析具体为：①图像增强：经醋酸地衣红染液染色后的染色体显示出异染色质带，经图像处理软件增强对比度后，染色体更加清晰显示出异染色质带；②带谱分析：检查每条染色体的异染色质带谱情况，记录每条染色体显带数量和...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛茂银，王霖娇，任学良，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，贵州师范大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52