一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法，该LAMP引物组包括一对内引物和一对外引物。本发明专利技术还公开了一种利用该引物组检测根串珠霉菌的检测方法。以本发明专利技术所设计的引物采用LAMP方法检测根串珠霉菌，不仅易于操作，对设备的要求低，而且具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测根串珠霉菌，能满足对根串珠霉菌快速准确检测的需要。

A lamp primer set and detection method for the detection of Moniliformes Rhizopus

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法
本专利技术属于植物保护领域，涉及常温扩增技术在农业部门病菌检测方面的应用，具体涉及一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法。
技术介绍
由根串珠霉菌(Thielaviopsisbasicola(Berk.etBr.)Ferr.)引起的烟草根黑腐病是危害烟草根部的主要病害之一。该病害在全球范围内都有分布，20世纪60年代主要发生在河南、山东、安徽、云南等地，70年代以后随着烟区的扩大，病害逐渐蔓延，近年来该病害在我国危害逐渐加重，其不仅影响了烟草的品质而且造成了严重减产。同时该病害在田间常与烟草黑胫病和其他根部病害混合发生，加重了其危害，也为病害的早期识别和诊断带来了困难，从而错过了最佳的防控时间和正确的防控措施。传统的植物病害检测方法因检测周期长、操作复杂、灵敏度低，且需要昂贵的仪器设备，难以快速、准确地做出鉴定。因此建立快速、简便、准确的检测方法，可对病害的早期诊断和及时防控提供科学依据。根串珠霉菌的检测方法包括光学显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子、厚垣孢子的形态特征及测量其大小；基于ITS序列设计特异性引物的常规PCR检测、以β-微管蛋白为靶基因设计特异性引物的常规PCR、实时荧光定量PCR以及双重PCR测定。上述测定方法中，光学显微镜镜检结果相对不准确，PCR检测需要PCR仪昂贵的仪器、耗时，且在鉴定过程中还需要使用大量有毒、有害化学试剂，对实验操作人员的健康有一定的威胁。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)的出现弥补了这一缺陷，其原理是针对靶序列6个区域设计4条引物，利用链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，恒温条件下准确高效扩增靶序列。LAMP较普通的PCR有特异性强、灵敏度高，成本低、时间短、结果可视化等优点，已经应用于细菌、真菌、病毒及寄生虫等多种致病微生物的检测。目前，LAMP检测技术已经用于烟草多种病害的检测中，其中包括青枯菌、烟草环斑病毒等，但是没有烟草根黑腐病菌LAMP检测体系的相关报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法，旨在应用LAMP法将恒温扩增技术运用于根串珠霉菌的快速检测，以期获得一种特异性好、灵敏度高、检测仪器简单且便于基层推广使用的根串珠霉菌检测技术。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组，其包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP，其DNA序列依次为：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，具体如下：F3(SEQIDNO.1)：5’-GGCCAGCATCAGTTTGTTGT-3’B3(SEQIDNO.2)：5’-CACCCAAACACTCGCACAT-3’FIP(SEQIDNO.3)：5’-GGTCCTCAGTCTGCCGAAAGGCAGGGAGAAAGGCTTAGGGA-3’BIP(SEQIDNO.4)：5’-GCAAGGATGCTGGCGTAATGGTAGGTTGACTCCTTGGTCCG-3’本专利技术还提供了一种利用上述引物组检测根串珠霉菌的检测方法，其包括如下步骤：1)DNA模板提取：从待测样品中提取DNA作为DNA模板；2)LAMP扩增：利用权利要求1的引物组对1)中的DNA模板进行LAMP扩增；3)检测：根据扩增结果判断待测样品中是否含有根串珠霉菌。在上述检测方法的基础上，本专利技术还具有如下进一步的具体选择：具体的，步骤2)中进行LAMP扩增的扩增体系为25μL反应体系，包括10×ThermopolBuffer2.5μL；浓度为100mM的MgSO41μL；浓度为10mM的dNTPMixture1.5μL；F3、B3、FIP和BIP各1μL；BstDNA聚合酶0.25μL；步骤1)中获得的DNA模板1μL；无菌双蒸水11.75μL；其中F3和B3的浓度为5μM、FIP和BIP的浓度为40μM。具体的，步骤2)进行LAMP扩增的反应条件为：将配制好反应体系的PCR管置于62℃水浴锅恒温反应60min；然后80℃，20min终止反应。具体的，步骤3)中采用电泳法对扩增结果进行检测判断，若产生特异梯状条带且加入SYBRGreenI后显绿色，则待测样品中含有根串珠霉菌；若未产生特异梯状条带且加入SYBRGreenI后显橘黄色，则待测样品中不含有根串珠霉菌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：检测时间短，效率更高，灵敏度更高，检测仪器简单，只需要简单的水浴锅，无需昂贵的PCR仪，降低了实验室投入，适合农业部门基层实验室的推广。附图说明图1为本专利技术实施例2中特异性验证的结果(其中M为DL2000DNAMarker，1-8为根串珠霉菌，9为烟草茎点霉菌，10为烟草拟盘多毛孢，11为烟草白星病菌，12为烟草碎叶病菌，13为烟草赤星病菌，14为腐霉菌，15为根霉菌，16为毛霉菌，17为意大利青霉菌，18为黄曲霉菌，19为烟草炭疽病菌，20为灰霉病菌，21为去离子水高温高压灭菌后作对照,图中上部的PCR管是相应样品中加入SYBRGreenI后显色情况，下部的为电泳结果)；图2为本专利技术实施例3中灵敏度验证时对应常规PCR法的结果(1-9为10倍稀释梯度浓度，依次为162ng/μL，16.2ng/μL，1.62ng/μL，162pg/μL，16.2pg/μL，1.62pg/μL，162fg/μL，16.2fg/μL，1.62fg/μL,10为阴性对照)；图3为本专利技术实施例3中灵敏度验证时对应本专利技术检测方法的结果(1-9为10倍稀释梯度浓度，依次为162ng/μL，16.2ng/μL，1.62ng/μL，162pg/μL，16.2pg/μL，1.62pg/μL，162fg/μL，16.2fg/μL，1.62fg/μL,10为阴性对照)；图4为本专利技术实施例4中实际样品的检测结果(图4A为选取的六株烟草植株的实物图，其中1-3为根部感染根串珠霉菌的植株，4-6为根部健康的植株，图4B为根部感染根串珠霉菌的植株1的根部显微切片，图4C为以本专利技术的检测方法进行根串珠霉菌检测的结果，图4C上部加入SYBRGreenI后显色情况，下部的为电泳结果)。具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。为免赘述，以下实施例中用到的方法若无特别说明则均为常规方法，用到的药品若无特别说明，则均为市售产品。实施例1引物的设计与合成以GeneBank中得到的28srDNA-ITS序列(GenBank:MF948659.1)的部分基因序列为靶基因，根据引物设计规则，多方面考虑后设计一批引物，合成并从中筛选出扩增速率最高、特异性好的一组LAMP引物，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP，其DNA序列依次为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP，其DNA序列依次为：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。


2.一种用于检测根串珠霉菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)DNA模板提取：从待测样品中提取DNA作为DNA模板；
2)LAMP扩增：利用权利要求1的引物组对1)中的DNA模板进行LAMP扩增；
3)检测：根据扩增结果判断待测样品中是否含有根串珠霉菌。


3.根据权利要求2所述的一种用于检测根串珠霉菌的检测方法，其特征在于，步骤2)中进行LAMP扩增的扩增体系为25μL反应体系，包括10×ThermopolBuffer2.5μL；浓度为100mM的MgSO41μL；浓度为10mM的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马冠华，王甲军，窦彦霞，董国菊，滕少娜，孙涛，
申请(专利权)人：西南大学，重庆海关技术中心，
类型：发明
国别省市：重庆;50