核酸检测试剂盒及其应用制造技术

本申请公开了一种核酸检测试剂盒，包括：高分子荧光编码微球、能够进行时间分辨的荧光微球、anti‑TAG序列、延伸产物核算基因序列和信号放大系统。本发明专利技术还公开了所述核酸检测试剂盒的使用方法。本发明专利技术的试剂盒基于把时间分辨荧光和高通量流式荧光互补结合的涉及思路，能够有效排除非特异性荧光，降低本底背景干扰，极大地提高分析的灵敏度和线性范围。

Nucleic acid detection kit and its application

【技术实现步骤摘要】
核酸检测试剂盒及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体的是涉及一种核酸检测试剂盒，可利用时间分辨流式荧光检测与核酸基因及其突变。
技术介绍
目前市场上检测核酸及突变的技术主要为荧光定量PCR及高通量测序，荧光定量PCR检测技术无法做到单管多个基因同时检测分型，通量相对较低；高通量测序检测技术设备投资要求高，操作较繁琐，数据较难处理。。本专利技术采用高通量的时间分辨荧光技术，可以实现核酸的联合检测，可避免非特异性荧光的干扰，降低本底信号，增加检测灵敏度，同时具有设备成本相对较低、特异性强、检测结果准确、可重复性好、通量高等优点。要实现该技术的优势，时间分辨微球和高分子荧光编码微球选择、引物和探针设计及反应体系优化都是至关重要的。在生物流体或血清检测中，因其中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法。时间分辨荧光技术目前是主要用在临床和科研上，它利用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素发光的特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分析，可以有效抵排除非特异性荧光，极大地提高分析的灵敏度，降低本底干扰，重复性好。目前时间分辨荧光技术不能有高通量一次检测多个指标，实现样本的批量处理。流式荧光技术流式荧光技术，是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术，又被称为液态芯片、悬浮阵列及xMAP技术等。平台中包含高分子荧光编码微球，其被两种光谱特性不同的荧光染料染色。通过精确控制两种荧光染料的浓度配比(10×10)，理论上可以获得一个100种荧光编码的微球阵列，每种微球表面可结合一种反应物。微球表面有活化羧基基团，可以与蛋白抗体的氨基或核酸探针的氨基共价交联。由于微球可通过其编码荧光被识别，因而可以实现在一个混合反应体系中同时进行100项反应的检测。另一种荧光物质(一般是澡红蛋白，非时间分辨荧光微球)与报告分子交联，用于测定微球表面生物反应的量。应用时，直接混合不同检测物的编码微球，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内即可以同时完成数十上几百种不同的生物学反应，而不相互干扰。最后用流式荧光检测类仪器进行分析，微球逐颗被两束激光进行分析。一束635nm的红色激光激发微球自身的荧光物质(聚苯乙烯编码微球)，而另一束532nm的绿色激光激发结合在微球表面的报告荧光物质(藻红蛋白、Alexa532或Cy3，非时间分辨荧光微球，时间分辨荧光用的是340nm或365nm的激光器激发)。高速的激光信号处理读取微球编码对其分类，同时对其表面的反应进行定量。每种检测物的检测读取100颗微球的信号值，取中位值。目前流式荧光检测荧光虽具有高通量、速度快、精度高、准确性好的特点，但信号影响因素很多，受到非特异性荧光的干扰，本底值高，检测灵敏度低，可重复性不高。截至目前，将时间分辨荧光和流式细胞技术互补结合用来检测核酸及其突变的方法还未查到相关报告。而本专利技术的时间分辨流式荧光检测核酸的技术即可避免非特异性荧光本底的干扰，又可以高通量批量处理样本，一次检测多个指标。
技术实现思路
本申请的主要目的在于提供一种核酸检测试剂盒及其应用，以采用能够进行时间分辨的荧光微球替代流式荧光中的澡红蛋白，克服流式荧光存在的缺点。为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了一种核酸检测试剂盒，包括：荧光编码微球、能够进行时间分辨的荧光微球、anti-TAG序列、延伸产物核算基因序列和信号放大系统。优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球的表面连接链霉亲和素或生物素，所述高分子荧光编码微球与所述anti-TAG序列连接。优选地，所述信号放大系统包括生物素和链霉亲和素。优选地，所述延伸产物核酸基因序列的获取方式为：通过多重聚合酶链式反应(PCR)获得目的核酸基因片段，然后经酶切及水解，去除多余的引物和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，再以等位基因特异引物延伸(allelespecificprimerextension,ASPE)，以形成延伸产物核酸基因序列。优选地，所述等位基因特异引物延伸的过程中使用生物素标记，并且，所述引物上含有Tag序列，所述Tag序列能相应地与anti-tag序列互补配对。优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球的荧光物质为量子点荧光物质或稀土镧系元素或其螯合物的液体或固体微球.优选地，所述稀土镧系元素选自铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)中的至少一种。本专利技术的另一个方面涉及所述的高通量时间分辨流式荧光分析核酸检测试剂盒的应用。本专利技术的技术方案具有以下优点：本专利技术的试剂盒基于把时间分辨荧光和高通量流式荧光互补结合的涉及思路，能够有效排除非特异性荧光，降低本底背景干扰，极大地提高分析的灵敏度，与化学发光相媲美，并且操作简单，生产过程中不需要透析。此外，本专利技术的试剂盒在使用过程中重复性好，试剂稳定性高。本专利技术的检测方法步骤简单，多种核酸及其突变位点可通过多重扩增和检测，大大提高了检测效率，本专利技术有效地提高了检测荧光信号值和检测灵敏度，增强了信噪比，使得检测结果更加准确可靠。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1是根据本申请实施例提供的一种高通量时间分辨流式荧光分析核酸检测试剂盒内各组分的微观结构示意图。附图标记1-高分子荧光编码微球；2-anti-TAG序列；3-延伸产物核酸基因序列(含有TAG序列，与anti-TAG互补)；4-生物素；5-时间分辨荧光微或量子点荧光微球；6-链霉亲和素。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：荧光编码微球、能够进行时间分辨的荧光微球、anti-TAG序列、延伸引物序列和信号放大系统，所述能够进行时间分辨的荧光微球选自时间分辨荧光微球和量子点荧光微球中的至少一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：荧光编码微球、能够进行时间分辨的荧光微球、anti-TAG序列、延伸引物序列和信号放大系统，所述能够进行时间分辨的荧光微球选自时间分辨荧光微球和量子点荧光微球中的至少一种。


2.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述能够进行时间分辨的荧光微球的表面连接链霉亲和素或生物素，所述高分子荧光编码微球与所述anti-TAG序列连接。


3.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述信号放大系统包括生物素和链霉亲和素。


4.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述延伸引物序列为包含TAG序列的ASPE引物，所述Tag序列能相应地与anti-tag序列互补配对。


5.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述能够进行时间分辨的荧光微球的荧光物质为量子点荧光微球或稀土镧系元素或其螯合物的液体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：高俊莉，高俊顺，高金波，
申请(专利权)人：杭州广科安德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33