一种三维培养扩增造血干细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种三维动态共培养体系来扩增造血干细胞，使用微囊作为滋养层细胞的生长体系，在三维动态条件中培养造血干细胞和滋养层细胞，动态环境有利于营养物质的传递，促进造血干细胞的增殖。三维共培养环境更接近体内造血微环境，滋养层细胞对造血干细胞的滋养、支持作用更接近在体模式，有利于造血干细胞的增殖和细胞活性的保持，同时微囊的半透膜可以有效隔离滋养层细胞和造血干细胞的免疫排斥，有效隔离滋养层细胞和造血干细胞，并且便于培养结束后造血干细胞的分离收获。本发明专利技术提供的三维培养扩增造血干细胞的方法，有望解决临床上造血干细胞数量不足的技术瓶颈。

A method of three-dimensional culture and expansion of hematopoietic stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种三维培养扩增造血干细胞的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种造血干细胞的扩增方法。
技术介绍
造血干细胞是最早应用于临床治疗的一种干细胞，其表面特异性表达CD34标志物，用于治疗恶性血液型疾病、免疫缺陷综合征、地中海贫血、严重创伤等疾病，均获得了良好的治疗效果。造血干细胞的来源广泛，可以从骨髓、外周血、脐带中获得，但是其绝对数量较少，如一个婴儿的脐血造血干细胞通常只能满足儿童和低体重成人患者，难以满足成人移植的需要。为了扩大造血干细胞的移植范围，需要对造血干细胞进行体外扩增，以产生足量的造血干细胞促进成人移植后中性粒细胞和血小板的恢复。因为造血干细胞是CD34+细胞，在培养扩增时可以通过两种形式：直接分离出单核细胞中的CD34+细胞进行培养扩增，或者培养扩增单核细胞来增加其中造血干细胞数量。目前常规的体外扩增造血干细胞的方法多为二维培养，使用高剂量多细胞因子联合培养，或者使用滋养层细胞（包括间充质干细胞、AGM区细胞等）与多细胞因子联合培养，这些方法具有明显的局限性：二维培养方式下，细胞丧失了在体特性，一定程度上易造成造血干细胞分化；来源不同的滋养层细胞和造血干细胞之间会产生排异，影响细胞活性；部分造血干细胞会粘附在滋养层细胞上，不利于两种细胞的分离与收获；静态共培养条件下，培养液缺乏有效混合，造成营养成分及代谢产物的不均一。三维培养可以模拟体内微环境，将滋养层细胞和造血干细胞在三维体系下进行共培养，可以更充分模拟体内环境，促进造血干细胞的增殖及保持干细胞特性。已有研究者采用微载体和海藻酸钙微胶珠作为三维培养基质，但是微载体仍然不能避免细胞间的直接接触造成后期分离困难，海藻酸钙微胶珠的大量微孔也不能阻止培养过程细胞脱落到培养液中与造血干细胞的直接接触。因此，本领域迫切需要建立适宜的三维动态共培养体系，同时有效隔离滋养层细胞和造血干细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种三维培养扩增造血干细胞的方法，解决临床上造血干细胞数量不足的技术瓶颈。本专利技术的技术方案是这样实现的：1.提供滋养层细胞。从人来源的脐带、脂肪、骨髓中分离得到间充质干细胞，加入10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，细胞接种密度为5×105cells/cm2，三天后清洗掉未贴壁细胞，当间充质干细胞融合度达到80%，加入0.05%的胰酶消化，按1:3比例进行传代培养。2.微囊化包埋滋养层细胞。收集滋养层细胞，按照1-10×106cells/mL密度接种于1.5%的海藻酸钠溶液，混合均匀后使用微胶囊高压静电制备仪滴加到1.1%的氯化钙溶液中，反应20-30分钟后得到海藻酸钙胶珠。将海藻酸钙胶珠与0.5-1%聚赖氨酸溶液按照体积比1:10进行成膜反应，反应5-15分钟后使用PBS洗涤三次。加入柠檬酸钠溶液进行液化反应，反应5-10分钟后，得到粒径200-500μm具有液化核心和半透膜的微胶囊。3.分离人脐血单核细胞。从健康产妇足月分娩的婴儿脐带中采集原血50-120mL，用密度1.077g/mL的Ficoll细胞分离液进行梯度离心后分离获得单核细胞。分离后的细胞使用IMDM基础培养基进行培养。4.分离造血干细胞。从已分离的单核细胞中使用细胞流式细胞仪分选出CD34+细胞，即造血干细胞。5.在搅拌式生物反应器中，三维共培养微囊化滋养层细胞与人脐血单核细胞（或造血干细胞）。将密度2-8×105cells/mL的人脐血单核细胞（或造血干细胞）与微囊化滋养层细胞接种到1-10L的搅拌式生物反应器中，使用IMDM基础培养基进行培养，调整搅拌转速为30-60rpm，使细胞和微囊充分混悬。6.分离造血干细胞和微囊，收获造血干细胞。培养结束后，将细胞和微囊混悬液经过不锈钢筛网进行分离，微囊被截留在筛网上方，将滤过液离心并使用IMDM基础培养基进行洗涤，计数。本专利技术的优点在于：1）在三维动态条件中培养造血干细胞和滋养层细胞，动态环境有利于营养物质的传递，促进造血干细胞的增殖。2）三维共培养环境更接近体内造血微环境，滋养层细胞对造血干细胞的滋养、支持作用更接近在体模式，有利于造血干细胞的增殖和细胞活性的保持。3）使用微囊作为滋养层细胞的生长体系，微囊的半透膜可以有效隔离滋养层细胞和造血干细胞的免疫排斥，并且便于培养结束后细胞的分离。附图说明下面以脐带间充质干细胞作为滋养层细胞，与人脐血单核细胞在1L生物反应器中共培养进行说明。图1是本专利技术所述的一种三维培养扩增造血干细胞的方法操作流程图。图2是本专利技术所述的一种三维培养扩增造血干细胞的方法中制备微囊化间充质干细胞的操作示意图。图3是本专利技术中制备的微囊化间充质干细胞的显微照片（10倍镜）。图4是本专利技术所述的一种三维培养扩增造血干细胞的方法中造血干细胞与微囊化间充质干细胞在搅拌式生物反应器中共培养的示意图。图5是本专利技术中分离的人脐血单核细胞在共培养前的流式检测图，检测其中CD34+细胞比例。图6是本专利技术所述的一种三维培养扩增造血干细胞的方法培养并收获人脐血单核细胞，进行的流式检测图，检测其中CD34+细胞比例。图7是本专利技术所述的一种三维培养扩增造血干细胞的方法培养并收获人脐血造血干细胞的增殖曲线。图中：1.注射泵；2.注射器；3.烧杯；4.微胶囊高压静电制备仪；5.搅拌式生物反应器；6.搅拌桨；7.微胶囊；8.微囊内滋养层细胞；9.微囊外的造血干细胞。具体实施方式本专利技术结合附图和实施例进行进一步的说明。实施例1一种三维培养扩增造血干细胞的方法，包括以下步骤：1.实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。2.滋养层细胞的分离和鉴定1）在健康产妇知情情况下获得脐带30cm，在手术室采集后即使用无菌PBS浸泡并运送到实验室，75%酒精浸泡1分钟并冲洗后放在10cm平皿中，无菌PBS冲洗3次。2）将脐带剪成5cm小段，用镊子撕开脐带并小心去除血管（包括2根动脉、1根静脉），小心将脐带撕成细丝。3）将细丝转移到50mL离心管中，加入10mLPBS混匀后，将手术剪插入离心管进行快速剪碎。4）向离心管加入10mL0.1%的I型胶原酶，将离心管放置在摇速90rpm，温度37℃的恒温摇床上进行消化2小时。5）取出离心管，此时组织块已消化，液体呈现粘稠状态，使用巴氏吸管进行吹打，并使用80目钢筛过滤，收集滤过液中细胞。6）将滤过液进行离心，转速1200rpm，离心5分钟，使用PBS离心洗涤2次。7）将离心后的细胞平均接种到4个25cm2培养瓶中，在CO2培养箱37℃培养，24小时后观察无细胞污染现象，继续培养48小时。8）取出培养瓶观察，有少量细胞贴壁，继续培养到细胞融合度80%，加入胰酶消化并传代。3.微囊化间充质干细胞的制备取第3代脐带间充质细胞，按照2×106cells/mL细胞密度与1.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维培养扩增造血干细胞的方法，其特征在于，实现此专利技术主要包括以下步骤：（1）提供滋养层细胞，从人来源的脐带、脂肪、骨髓中分离得到间充质干细胞，（2）微囊化包埋滋养层细胞，（3）分离人脐血单核细胞，从健康产妇足月分娩的婴儿脐带中采集原血并分离获得单核细胞，检测其中CD34+细胞比例，（4）分选CD34+细胞，从已分离的单核细胞中通过细胞分选获得CD34+的造血干细胞，（5）在搅拌式生物反应器中，三维共培养微囊化滋养层细胞与人脐血单核细胞（或造血干细胞），（6）分离脐血单核细胞（或造血干细胞）和微囊，收获造血干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种三维培养扩增造血干细胞的方法，其特征在于，实现此发明主要包括以下步骤：（1）提供滋养层细胞，从人来源的脐带、脂肪、骨髓中分离得到间充质干细胞，（2）微囊化包埋滋养层细胞，（3）分离人脐血单核细胞，从健康产妇足月分娩的婴儿脐带中采集原血并分离获得单核细胞，检测其中CD34+细胞比例，（4）分选CD34+细胞，从已分离的单核细胞中通过细胞分选获得CD34+的造血干细胞，（5）在搅拌式生物反应器中，三维共培养微囊化滋养层细胞与人脐血单核细胞（或造血干细胞），（6）分离脐血单核细胞（或造血干细胞）和微囊，收获造血干细胞。


2.根据权利要求1所述的三维培养扩增造血干细胞的方法，其特征在于，所述滋养层细胞包括脐带、骨髓、脂肪来源的间充质干细胞。


3.根据权利要求1所述的三维...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈传果，王雨，
申请(专利权)人：陈传果，
类型：发明
国别省市：广东;44