强化ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种强化

Bacillus licheniformis with enhanced expression of PPC and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
强化ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用
本专利技术属于基因工程菌改造
，尤其是一种强化磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用。
技术介绍
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，其组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn），D-苯丙氨酸（D-Phe），异亮组氨酸（His）,D-天冬氨酸（D-Asp）,天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）,D-谷氨酸（D-Glu），半胱氨酸（Cys），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽又名枯草菌素，其可以抑制或杀灭某些致病菌，有效抑制革兰氏阳性菌如梭状芽胞杆菌属的生长，并与其它抗生素（如青霉素、庆大霉素等）具有协同增强效应；另外，杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄较迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。PpC为一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其在生物体的中心碳代谢中发挥着作用，然而，目前的研究并没有解析出PpC的具体功能。并且，地衣芽胞杆菌自身并无PpC的转录基因—ppc基因。因此，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PpC在地衣芽胞杆菌中是否会发挥功能并影响杆菌肽合成并不清楚。再加上，细胞内的中心碳代谢、氨基酸代谢具有严格且复杂的调控机制。因此，通过改造ppc基因是否会影响地衣芽胞杆菌中杆菌肽的产量以及PpC的表达水平与杆菌肽产量之间的关系均是不可预知的。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种强化磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc表达的地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的制备方法，此构建方法通过在地衣芽胞杆菌的基因组内插入磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，达到了提高杆菌肽产量的目的。一种强化ppc表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：（1）以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组为模板，PCR扩增出ppc基因片段，再在ppc基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成完整的ppc表达元件；（2）同时，以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ppc基因插入位点的上游同源臂和下游同源臂；（3）将插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和插入位点的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：插入位点的上游同源臂-ppc表达元件-插入位点的下游同源臂；（4）准备整合型质粒载体，并根据整合型质粒载体上的酶切位点选择能够对该整合型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对整合型质粒载体和步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；（5）将步骤（4）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到整合质粒；（6）将步骤（5）得到的整合质粒转入地衣芽胞杆菌DW2中，并采用含有筛选标记的培养基进行筛选得到阳性转化子，并对阳性转化子抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子进行转接培养数次后再次进行菌落PCR检测，得到插入位点的上游同源臂或插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（7）挑选插入位点的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于30~37℃、不含有筛选标记的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了ppc基因的地衣芽胞杆菌DW2-ppc（简称：BacilluslicheniformisDW2-ppc）；其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2011344；所述谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中的ppc基因序列如SEQUENCELISTING中所示。优选的，步骤（1）中启动子选用P43启动子，P43启动子是芽胞杆菌通用的强启动子，普适性较强。在具体实施过程中，所述P43启动子通常通过以枯草芽胞杆菌基因组为模板经PCR扩增得到。优选的，步骤（1）中终止子选用淀粉酶终止子，淀粉酶终止子为菌种基因改造领域比较通用的终止子。进一步的，所述淀粉酶终止子采用以地衣芽胞杆菌DW2基因组为模板经PCR扩增得到的淀粉酶终止子，此时无需另行购买淀粉酶终止子的来源菌株。优选的，步骤（3）中通过重叠延伸PCR将插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和插入位点的下游同源臂连接到一起。相对于多步酶切酶连的方法相比，具有效率高、速度快、方法简单的优点。优选的，步骤（4）中整合型质粒载体选用T2(2)-ori，采用XbaI和NotI限制性内切酶对整合型质粒载体和目的基因片段进行双酶切，步骤（6）中将整合质粒转入地衣芽胞杆菌DW2中后，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并将验证成功的阳性转化子在40~45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到阳性单交换结合子菌株。T2(2)-ori为本申请人所在研究课题组已有的质粒载体，该质粒载体为常用的基因敲除/插入载体，容易获得，并且该质粒为温敏性质粒，易于筛选；当选用T2(2)-ori时，通过对该整合型质粒载体的基因组进行分析可知：其上存在XbaI和NotI限制性内切酶切位点，进而确定双酶切步骤采用XbaI和NotI限制性内切酶；与此同时，T2(2)-ori质粒载体的基因组中还含有卡那青霉素抗性基因，因此，在步骤（7）中可采用卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并且，T2(2)-ori质粒载体适宜在40~45℃条件生长，因此，将验证成功的阳性转化子在40~45℃条件下进行转接培养，以得到阳性单交换结合子菌株。本专利技术人首次尝试构建强化ppc基因表达的地衣芽胞杆菌DW2-ppc，与地衣芽胞杆菌DW2相比，通过本专利技术构建得到的地衣芽胞杆菌DW2–ppc的杆菌肽产量提高了12%以上。本专利技术的研究结果表明：强化表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。本专利技术的目的之二在于提供根据上述的强化ppC表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ppc。本专利技术的目的之三在于提供地衣芽胞杆菌DW2-ppc在杆菌肽生产中的应用，所述地衣芽胞杆菌DW2-ppc为根据上述的强化ppC表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ppc。进一步的，所述应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵，其中种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH7.0~7.2；生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO3和0.5-2g/L(NH4)2SO4。附图说明图1为实施例1~14的步骤（1）中得到的ppc基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为ppc基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.强化

【技术特征摘要】
1.强化ppc表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组为模板，PCR扩增出ppc基因片段，再在ppc基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成完整的ppc表达元件；
（2）同时，以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ppc基因插入位点的上游同源臂和下游同源臂；
（3）将插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和插入位点的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：插入位点的上游同源臂-ppc表达元件-插入位点的下游同源臂；
（4）准备整合型质粒载体，并根据整合型质粒载体上的酶切位点选择能够对该整合型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对整合型质粒载体和步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；
（5）将步骤（4）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到整合质粒；
（6）将步骤（5）得到的整合质粒转入地衣芽胞杆菌DW2中，并采用含有筛选标记的培养基进行筛选得到阳性转化子，并对阳性转化子抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子进行转接培养数次后再次进行菌落PCR检测，得到插入位点的上游同源臂或插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（7）挑选插入位点的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于30~37℃、不含有筛选标记的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了ppc基因的地衣芽胞杆菌DW2-ppc；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2011344；
所述谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中的ppc基因序列如SEQUENCELISTING中所示。


2.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，蔡冬波，吴非，杨帆，李俊辉，陈晓斌，季潇炜，楼丽君，邱湘琪，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35