一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法，水蛭素位于融合表达的N末端，核酸酶位于融合表达的C末端，中间为DDDDK序列，具体结构如下所示：Hirudin‑DDDDK‑NUC。本发明专利技术首次利用水蛭素封闭活性并利用水蛭素的高表达以获得了高产量、高比活、低成本灵杆菌核酸酶。

A highly efficient method of secretory fusion expression and recombinant preparation of lingbacilli nuclease in methanol yeast

【技术实现步骤摘要】
一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法。
技术介绍
能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，称为核酸酶(nuclease，简称NUC)，它属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。灵杆菌核酸酶是来源于粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens，又称灵杆菌)的非限制性广谱核酸酶，可在核酸链内的任意核苷酸间进行切割，并可切割任意形式的核酸(单链、双链、线状、环状或超螺旋形式的DNA或RNA)。灵杆菌核酸酶酶切效率远高于其它核酸酶，活性是牛胰DNaseI的34倍、金黄葡萄球菌核酸酶的6倍。该酶已广泛用于去除疫苗和蛋白、多糖类药物的核酸污染，可将产品中的核酸污染降低至皮克级，具有广阔的应用市场。然而，灵杆菌是一种致病菌，对其大规模培养存在较大风险。目前商品化的灵杆菌核酸酶主要利用大肠杆菌系统重组制备。迄今为止，市场上的主导产品为Merck公司生产的商品名为Benzonase的灵杆菌核酸酶，该产品已通过美国FDA的使用许可，广泛用于除去生物制品中的核酸。但因其对宿主菌大肠杆菌有毒性且纯化方法复杂，故产量低价格昂贵。国外产品(Sigma及Merck)100万单位(约为1mg)售价约为3万元至8万元人民币，国内生产厂家较少。目前公开报道灵杆菌核酸主要为单体、非融合制备，表达后即具有降解核酸的活性，对宿主菌毒性较大，培养过程菌体死亡率高、无法高效制备。医药工业急需一种高效重组制备灵杆菌核酸酶的方法，降低其生产成本，扩大应用范围。利用大肠杆菌原核表达系统对目的蛋白进行非活性形式包涵体制备，是制备毒性蛋白的通用做法，但包涵体蛋白纯化复性困难，回收率较低，工业化制备成本较高；同时，是否形成包涵体与蛋白本身的结构特点有关，并非所有蛋白均可进行包涵体制备。重组融合表达是指通过基因重组手段串联表达含有多个蛋白多肽编码基因的生物技术。对某些稳定性差、常规重组表达难制备的蛋白多肽，将其与另一可高效表达的蛋白进行融合表达，可克服上述缺陷并实现目的蛋白的高效重组制备。目前，该技术已普遍应用于大肠杆菌原核表达系统。将目的蛋白与金黄色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-转移酶、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白、大肠杆菌硫氧还蛋白等构建原核融合表达体系。然而，上述表达系统设计初衷为借助融合伴侣蛋白溶解性好、表达效率高等特性，使目的蛋白亦获得高效可溶性表达，融合蛋白可促进活性目的蛋白构建表达，但并不能有效封闭目的蛋白生物活性。同时，因大肠杆菌缺少胞外分泌系统，重组蛋白无法分泌至细胞外，多数积累于细胞质中。对于毒性较大蛋白，活性形式表达量越高，对宿主细胞的毒性越大，无法用于毒性大蛋白的高效表达制备。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要包含毕赤酵母(PichiaPastoris)、汉逊酵母(HansenulaPolymopha)和假丝酵母(CandidaBodinii)。甲醇酵母表达系统是近年来发展迅速的重组表达系统，不仅具有原核生物生长快、操作简便的特点，还可将外源蛋白通过一定的途径高效分泌至细胞外，胞内累积量较少，大幅降低了外源蛋白的细胞内毒性，同时可简化分离纯化步骤，降低制备成本。水蛭素是源于水蛭头部唾液腺的一类由64-69个氨基酸组成的活性多肽，可作为凝血酶特异性抑制剂，用于血栓性疾病的治疗，目前已上市的重组水蛭素类多肽药物包括Lepirudin和Desirudin。天然水蛭素含有10种变异体，其中研究最多的是三种水蛭素变异体(Hirudinvariants，HV)，即HV1、HV2和HV3。水蛭素含有3对二硫键，无法利用大肠杆菌高效表达制备，但可在酵母系统中高效分泌表达，其中活性HV1在毕赤酵母中的表达量可达到2.0g/L。另一方面，水蛭素蛋白结构刚性较强，具有封闭与之融合表达蛋白的生物活性的潜在特性，可降低目的蛋白毒性，具有作为融合表达体系制备毒性较大蛋白的可能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶(NUC)的方法。其融合表达特征为：水蛭素位于融合蛋白的N末端，NUC位于融合蛋白的C末端，中间为肠激酶酶切位点(DDDDK)，具体结构如下所示：Hirudin-DDDDK-NUC。本专利技术所述水蛭素指天然水蛭素-1(HV1，如SEQIDNO：1所示)、天然水蛭素-2(HV2，如SEQIDNo：2所示)，以及具有相同生物活性的水蛭素突变体中的一种以上。水蛭素突变体是指经过个别氨基酸的取代、缺失或增加而得到的水蛭素多肽，生物活性与天然水蛭素基本相同。优选的，所述水蛭素突变体如SEQIDNo：3所示。本专利技术中的灵杆菌核酸酶，包括但不限于灵杆菌核酸酶全长结构(如SEQIDNo：4所示)以及具有相同生物活性的灵杆菌核酸酶突变体。本专利技术所述甲醇酵母包括毕赤酵母(PichiaPastoris)、汉逊酵母(HansenulaPolymopha)和假丝酵母(CandidaBodinii)等能够利用甲醇作为唯一碳源的酵母。优选的，所述甲醇酵母为毕赤酵母。为了实现上述的目的，本专利技术的技术方案如下：一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法，包括如下步骤：(1)构建含水蛭素和灵杆菌核酸酶融合基因的酵母分泌型载体；(2)转化甲醇酵母宿主菌，筛选高效分泌表达菌株；(3)发酵和重组融合蛋白的分离纯化；(4)重组融合蛋白的单一蛋白酶酶切；(5)灵杆菌核酸酶蛋白的分离纯化。优选的：所述步骤(1)中分泌型载体pPIC9、pPIC9K、pPICZα、pGAPZα等。优选的，分泌型载体是pPIC9K和pPICZα。优选的：所述步骤(2)中宿主菌毕赤酵母宿主菌：GS115、X-33、KM71和SMD1163等。优选的，所述步骤(2)中甲醇酵母宿主菌是GS115和X-33。优选的：所述步骤(2)中转化为通过电转化或原生质体转化等方法将载体转入宿主菌；所述筛选高效分泌表达菌株为采用抗性加压等合适条件筛选重组子，通过测定诱导表达融合蛋白量确定优选表达菌株。优选的：所述步骤(3)中发酵为将筛选的工程菌经活化、种子液培养及发酵罐高密度培养后，加入诱导剂(如甲醇)诱导融合蛋白分泌表达。所述融合蛋白的分离纯化方法可以为超滤、沉淀、离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、反相层析以及分子排阻层析的一种以上。优选的：所述步骤(4)中单一蛋白酶酶切为采用肠激酶将灵杆菌核酸酶与水蛭素有效酶切分离，且在目的蛋白多肽N末端不包含任何多余氨基酸残基。优选的：所述步骤(5)中目的多肽的分离纯化选自超滤、沉淀、离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、反相层析以及分子排阻层析的一种以上。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术将水蛭素作为伴侣蛋白与生物毒性较大的灵杆菌核酸酶构建融合蛋白并采用甲醇酵母分泌表达系统，借助水蛭素表达效率高及刚性强、可封闭核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法，其特征是：水蛭素位于融合表达的N末端，核酸酶位于融合表达的C末端，中间为DDDDK序列，具体结构如下所示：Hirudin-DDDDK-NUC。/n

【技术特征摘要】
1.一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法，其特征是：水蛭素位于融合表达的N末端，核酸酶位于融合表达的C末端，中间为DDDDK序列，具体结构如下所示：Hirudin-DDDDK-NUC。


2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述水蛭素为天然水蛭素-1或/和天然水蛭素-2。


3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述甲醇酵母选自毕赤酵母、汉逊酵母或假丝酵母中的一种以上。


4.一种在甲醇酵母中高效分泌融合表达以及重组制备灵杆菌核酸酶的方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)构建含水...

【专利技术属性】
技术研发人员：张淳，张增涛，姜亮，赵志龙，史晓委，张海娟，
申请(专利权)人：山东仁瑞生物科技有限公司，临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37