从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素融合蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白‑类胰岛素生长因子‑1融合蛋白(OsrHSA‑IGF‑1)的方法。具体步骤为先从重组人血清白蛋白‑类胰岛素生长因子融合蛋白基因工程水稻种子中提取含有OsrHSA‑IGF‑1的粗提取液，将粗提取液经MMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I；将初级产物I经Adhere复合阴离子交换层析或经Cibacron blue F3GA亲和层析，得到纯化的重组人血清白蛋白‑类胰岛素生长因子‑1融合蛋白目标物。本发明专利技术提取纯化方法简便高效，成本低，同时所得OsrHSA‑IGF‑1具有纯度高，活性好的特点。

Purification of recombinant human serum albumin insulin like fusion protein from genetically engineered rice seeds

【技术实现步骤摘要】
从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素融合蛋白的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法。
技术介绍
胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，简称IGF-1)是一类多功能细胞增殖调控因子，对细胞的分化、增殖和个体的生长发育具有重要的促进作用(LeRoith,1997)。IGF-1，除了由肝脏分泌通过循环系统到达靶组织，作用于靶细胞及靶器官，介导生长激素的生物效应；也能以自分泌或旁分泌的方式由局部组织细胞产生，参与对机体器官生长代谢的调节(ButlerandLeRoith,2001)。在临床上，IGF-1已被广泛地用于治疗生长激素受体缺陷、生长激素不敏感综合症，IGF-1基因缺失，以及生长激素信号传导受阻的各类病人(Savageetal.,2004)。此外，由于IGF-1与胰岛素有的50％的同源序列，具有类似胰岛素的代谢作用：促进组织摄取葡萄糖，刺激糖原异生和糖酵解；促进糖原合成，促进蛋白质和脂肪合成，抑制蛋白质和脂肪分解，减少血液游离脂肪酸和氨基酸的浓度，因此，IGF-1也被用于I型和II型糖尿病病人(Clemmons,2007)以及具有严重胰岛素抵抗的胰岛素受体基因突变病人的治疗(De,KerdanetM,etal.，2017)。IGF-1在天然状态下的含量极低，直接从动物血液或者奶源中提取IGF-1十分困难。目前主要是通过重组DNA技术进行表达生产，已在包括大肠杆菌，酵母，基因工程植物和动物、细胞系在内的一系列表达体系中成功表达。但在这些表达系统中，大肠杆菌容易形成包涵体，需要变性复性获得具有活性的IGF-1，由于复性困难使得IGF-1活性很低，且回收率极低；采用酵母分泌方式表达的IGF-1取得成功，但因发酵前后形成结构不均一状态；基因工程动物和细胞系表达生产的成本十分高昂；利用叶片表达的基因工程植物生产IGF-1存在提取纯化困难等问题，同时，表达量较低且稳定性较差。本专利技术人采用农业生物制药技术，依托稻胚乳细胞生物反应器的高效表达技术平台及重组蛋白纯化技术平台，采用水稻胚乳细胞高效表达重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白(OsrHSA-IGF-1)，表达的OsrHSA-IGF-1具有与天然蛋白类似的均一结构和活性，提取纯化工艺简单成本低廉等优点。
技术实现思路
本专利技术目的：提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白(OsrHSA-IGF-1)的方法，包括以下步骤：1)从重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子融合蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的蛋白粗提取液；2)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的蛋白粗提取液经CaptoMMC或BestaroseDiamondMMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I；3)将初级产物I经CaptoAdhere或BestaroseDiamondAdhere复合阴离子交换层析，得到纯化的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物；或者在另一技术方案中，将初级产物I经CibacronblueF3GA亲和层析，得到纯化的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物；进一步的上述方法包含以下步骤：(1)将基因工程稻谷脱壳，然后抛光成半精米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1:5～1:10(kg/L)的比例混合，于25～60℃提取1～2小时。提取缓冲液的成分为：5～20mM磷酸盐、5～10mM醋酸钠、0～250mM氯化钠、10～30mM硫酸铵、10～20mM辛酸钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，pH7.3～7.6。将上述得到的混合物用20％乙酸调节pH至5.4～5.6，放置沉淀2～8小时后，加入2～5％的珍珠岩进行压滤，0.22μm滤膜过滤后即为OsrHSA-IGF-1的粗提取液。(2)采用CaptoMMC或BestaroseDiamondMMC层析介质进行初级分离纯化。采用4～6个柱体积的平衡缓冲液(5～20mM磷酸盐、5～20mM醋酸钠，0～20mM柠檬酸三钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，pH为5.4～5.6)，以170～240cm/h的线性流速平衡层析柱；以步骤(1)的调配液为层析上样缓冲液，其中上样缓冲液pH为5.4～5.6，上样体积15～25柱体积；上样结束后用平衡缓冲液对层析柱进行再平衡3～5柱体积；用1～3柱体积洗杂缓冲液I(0～25mM磷酸盐、0～20mM柠檬酸三钠，20～40mM醋酸钠、0～15％(V/V)异丙醇，pH为4.8～5.2)，以170～240cm/h的线性流速进行洗杂0～3倍柱体积，再用3～5倍柱体积洗杂缓冲液II(0～25mM磷酸盐、0～20mM柠檬酸三钠，20～40mM醋酸钠、0～15％(V/V)异丙醇，0.9～1.4M氯化钠,pH为4.8～5.2,电导70～89mS/cm)进行再第二次洗杂：最后用洗脱缓冲液(20mM磷酸盐、0～20mM柠檬酸三钠，0～20mM醋酸钠、500mM氯化钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，pH6.3～6.6)进行洗脱，收集含有OsrHSA-IGF-1的洗脱液，获得含4～6个柱体积的初级产物I；(3)采用CaptoAdhere或BestaroseDiamondAdhere层析介质进行第二步分离纯化。采用4～6个柱体积的平衡缓冲液I(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.9～7.1)，以120～300cm/h的流速平衡柱子；将步骤2的含OsrHSA-IGF-1的洗脱液中加入约等体积的纯水，并调节pH至6.9～7.1，作为此步层析的上样液，样品电导控制在24-29mS/cm；上样结束后用3～5柱体积的平衡缓冲液对层析柱进行再平衡；用洗杂缓冲液I(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠、10％异丙醇，1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.9～7.1)进行第一次洗杂，洗杂缓冲液体积为4～6个柱体积；然后用平衡缓冲液II(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.9～7.1)，进行第二次再平衡，平衡体积为4～6个柱体积；再用洗杂缓冲液II(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH为5.9～6.4)进行第二次洗杂，所用洗杂液为4～6柱体积；最后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH为3.5～4.5)进行洗脱，获得纯度95％以上的OsrHSA-IGF-1融合蛋白；(4)在另一技术方案中，采用CibacronblueF3GA亲和层析介质进行第二步分离纯化。采用4～6个柱体积的平衡缓冲液(20mM醋酸钠，pH为5.0～5.8)，以120～300cm/h的流速平衡柱子；将步骤2的含OsrHSA-IG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法，包括以下步骤：/n1)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的基因工程水稻种子与pH为7.0-7.6,含有5-20mM磷酸盐、5-10mM醋酸钠、0-250mM氯化钠、10-30mM硫酸铵、10-20mM辛酸钠，0-1mM还原型谷胱甘肽的提取缓冲液混合并静置提取后，在pH 5.4-5.6条件下酸沉，得到含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的粗提取液；/n2)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的粗提取液经MMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I；/n3)将步骤2)的初级产物I进行进一步Adhere复合阴离子交换层析或Cibacron blueF3GA亲和层析纯化，得到纯度大于95％的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物。/n

【技术特征摘要】
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的基因工程水稻种子与pH为7.0-7.6,含有5-20mM磷酸盐、5-10mM醋酸钠、0-250mM氯化钠、10-30mM硫酸铵、10-20mM辛酸钠，0-1mM还原型谷胱甘肽的提取缓冲液混合并静置提取后，在pH5.4-5.6条件下酸沉，得到含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的粗提取液；
2)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的粗提取液经MMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I；
3)将步骤2)的初级产物I进行进一步Adhere复合阴离子交换层析或CibacronblueF3GA亲和层析纯化，得到纯度大于95％的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物。


2.根据权利要求1所述的分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法，其特征在于步骤2)中将所述粗提取液经CaptoMMC或BestaroseDiamondMMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I。


3.根据权利要求1所述的分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法，其特征在于步骤3)中将初级产物I经CaptoAdhere或BestaroseDiamondAdhere复合阴离子交换层析，得到纯化的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物。


4.根据权利要求1所述的分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法，其特征在于步骤3)中将初级产物I经CibacronblueF3GA亲和层析，得到纯化的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物。


5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的提取方法为：将基因工程稻谷脱壳研磨后与提取缓冲液以1:5-1:10(kg/L)的比例混合，于25-60℃提取1-2小时；所述提取缓冲液含有5-20mM磷酸盐、5-10mM醋酸钠、100mM氯化钠、10-30mM硫酸铵、10-20mM辛酸钠，0-1mM还原型谷胱甘肽，pH为7.0-7.6；
将上述得到的混合物调节pH至5.4-5.6，放置沉淀2-8小时进行酸沉，过滤后上清液即为OsrHSA-IGF-1的粗提取液。


6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)MMC复合阳离子交换层析方法为：采用pH为5.4-5.6的含有5-20mM磷酸盐、5-20mM醋酸钠，0-20mM柠檬酸三钠，0-1mM还原型谷胱甘肽的平衡缓冲液，以170-240cm/h的流速平衡层析柱；
以步骤1)的粗提取液为层析上样液，上样结束后用所述平衡缓冲液对层析柱进行再平衡；用含有0-25mM磷酸盐、0-20mM柠檬酸三钠，20-40mM醋酸钠、0-15％(V/V)异丙醇，pH为4.8-5.2的洗杂液I，以170-240cm/h的流速进行洗脱杂蛋白；
用含有0-25mM磷酸盐、0-20mM柠檬酸三钠，20-40mM醋酸钠、0-15％(V/V)异丙醇，0.9-1.4M氯化钠的pH为4.8-5.2,电导为70-89mS/cm的洗杂液II进行第二次洗杂；
以含有20mM磷酸盐、0-20mM柠檬酸三钠，0-20mM醋酸钠、500mM氯化钠，0-1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.3-6.6的洗脱液进行洗脱，收集含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的洗脱液，获得初级产物I。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)的MMC层析条件为：
平衡液：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH5.4-5.6；
洗杂液I：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，10％(V/V)异丙醇，pH4.8-5.2；
洗杂液II：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，10％(V/V)异丙醇，1.4M氯化钠，pH4.8-5.2；
洗脱液：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，0.5M氯化钠，pH6.3-6.6。


8.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，欧吉权，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42