CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测多溴联苯的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CdTe标记抗体以及利用其检测多溴联苯的方法，首先制得CdTe标记抗体，通过待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，洗涤除去多余的游离标记抗体，置于荧光酶标仪上读数。当CdTe标记抗体量一定时，若待测样品中的多溴联苯含量越多，与固相抗原结合的CdTe标记抗体就越少，荧光值越低，抑制率越高，反之，则荧光值越高，抑制率降低，根据事先得到的多溴联苯的标准曲线和待测样品的抑制率，可计算出待测样品中的多溴联苯的含量。本发明专利技术公开的的检测方法特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、安全可靠，不需要贵重仪器和复杂的前处理过程同时对分析人员的专业技术要求不高,容易普及和推广。

Preparation and application of CdTe labelled antibody and detection of PBBs

【技术实现步骤摘要】
CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测多溴联苯的方法
本专利技术涉及多溴联苯检测领域，具体涉及一种CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测多溴联苯的方法。
技术介绍
多溴联苯(polybrominatedbiphenyls，PBBs)是溴代阻燃剂的一种,由于其优良的阻燃效率、热稳定性而被广泛应用于建材、纺织、化工等行业。PBBs及其代谢产物可使人的大脑、肝脏和肾脏等器官以及神经系统、内分泌系统、生殖系统等产生急性或慢性毒性，具有“致癌、致畸和致突变”三致作用，在环境中难降解，亲脂性高，可生物富集并产生放大效应。鉴于其毒性，PBBs的应用已受到密切的关注和控制。为了保护环境以及人类生态健康，PBBs类有机污染物已被欧盟和中国等众多法律法规与标准列为禁止使用。由于PBBs在环境介质中广泛分布，以及明显的生物富集作用，在很多食物中都检测出，包括饮用水、海洋鱼类及其产品、牛奶、鸡蛋、肉类和蔬菜等，因此食品中的PBBs类物质的污染状况值得关注。目前，食品中的PBBs的提取方法主要有索氏萃取、液液萃取、加速溶剂萃取、固相微萃取、微波辅助萃取等，净化步骤多采用凝胶渗透色谱结合多层硅胶柱净化，前处理方法较为繁琐。测定方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法和液相色谱-串联质谱法；高分辨气相色谱-高分辨质谱法(HRGC-HRMS)等。由于GC和GC-MS分析方法灵敏度较低，都易产生假阳性，HRGC-HRMS的仪器设备贵、对环境条件和人员要求高，不适于方法的推广。而使用GC-MS/MS进行检测时，二级质谱扫描的母离子一般选择一级质谱上丰度最高的离子，母离子再通过四极杆后产生特征子离子，形成离子对，通过监测一个或多个离子对，使化合物分析的准确度和精确度进一步提高但也存在都存在同时分析和色谱柱容易污染等问题，需要不同的测定手段。以上方法存在的问题是前处理步骤复杂,操作费时,分析成本高,需要熟练的技术人员及较长的分析周期,对大批复杂试样不能及时报出结果。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于现有技术中多溴联苯检测方法步骤复杂,操作费时,分析成本高，对环境条件和人员要求高等缺陷，从而提供了一种CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测多溴联苯的方法。为此，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种CdTe标记抗体的制备方法，包括如下步骤：对硝基多溴联苯还原后，再与牛血清白蛋白进行偶联，制成多溴联苯抗原，最后对多溴联苯抗原进行动物免疫实验，制得多溴联苯抗体；向CdTe量子点溶液中加入交联剂，并静置，然后再向其中加入多溴联苯抗体，于3-5℃反应40-60h，用磷酸盐缓冲溶液透析后，制得CdTe标记抗体。进一步地，所述多溴联苯抗原的制备具体为，使半抗原、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在N,N-二甲基甲酰胺搅拌反应6-10h，在3-5℃过夜，然后将反应产物离心分离得到上清液，与牛血清白蛋白在pH值为7-8的磷酸盐缓冲溶液中，冰浴条件下反应3-5h，之后使用生理盐水透析5-7d，得到多溴联苯抗原，其中半抗原、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和牛血清白蛋白的摩尔比为1:0.5-1:0.5-1:0.5-1；所述动物免疫实验为选择成年健康雄性新西兰白兔,将多溴联苯抗原经过与弗氏完全佐剂充分混合后,对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫,经过加强免疫后,采用试管法和双白琼脂扩散试验考察其抗血清效价，获得多溴联苯抗体，其中多溴联苯抗原和弗氏完全佐剂的摩尔比是1:0.5-1。进一步地，半抗原可以通过如下方法制备得到：使硝基多溴联苯和氯化亚锡在浓盐酸和二氯甲烷环境中在25-35℃水浴上搅拌反应2-4h，反应结束后加入NaOH固体，搅拌至溶液呈强碱性，然后把反应混合物倾入蒸馏水的烧杯中，加入乙醚分次萃取取有机层，用饱和食盐水洗涤有机层，然后用无水MgSO4干燥，蒸去乙醚，得到半抗原，其中硝基多溴联苯和氯化亚锡的摩尔比为1:7-10。优选地，所述CdTe量子点溶液的摩尔浓度为1×10-3-2×10-3mol/L；多溴联苯抗体的浓度为0.5-2.0g/L；CdTe量子点溶液、多溴联苯抗体和交联剂的体积比为5-10:10-20:0.5-1；优选地，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的混合溶液，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的体积比为1:(0.5-2)，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的摩尔浓度均为0.05-0.2mol/L。进一步地，CdTe量子点溶液中CdTe量子点的制备方法，包括如下步骤：将CdCl2·2.5H2O和巯基乙酸在惰性气氛下溶于水中，调节pH值至11.5-12.5，然后加入NaHTe溶液，控制CdCl2·2.5H2O、NaHTe溶液和巯基乙酸的比例为0.05-0.1g：50-100μL：50-100μL，得到CdTe量子点前躯体；将所述的CdTe量子点前驱体于140-160℃加热5-60min后，在依次进行冷却、洗涤和离心，制得CdTe量子点本专利技术还提供一种制备方法制得的CdTe标记抗体检测多溴联苯的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：包被：以0.03-0.06mol/LpH值9-10的碳酸盐缓冲溶液将多溴联苯抗原稀释至1-10μg/mL，然后加至荧光酶标板，加入量90-120μL/孔，4-5℃过夜；S2：封闭：将包被好的标板取出，待其恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，然后加入卵清蛋白含量为0.5-1.5％wt的磷酸盐缓冲溶液150-250μL/孔进行封闭，最后在35-40℃温育0.5-1h；S3：制备多溴联苯的标准抑制曲线：将封闭后的标板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，使用一系列标准浓度的多溴联苯标准溶液样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，取出反应后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，用荧光酶标仪测定荧光强度，然后根据抑制率对多溴联苯浓度作图，得到多溴联苯的标准抑制曲线；S4：测量待测样品：重复步骤S2和步骤S3，将封闭后的板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，使用待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，然后在35-40℃温育0.5-2h；取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，用荧光酶标仪测定荧光强度，将待测样品的荧光强度代入多溴联苯的标准抑制曲线中，计算得知待测样品中多溴联苯的含量。进一步地，步骤S3中，一系列标准浓度的多溴联苯标准溶液样品为浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的磷酸盐缓冲溶液。进一步地，步骤S3中，使用一系列标准浓度的多溴联苯标准溶液样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，包括，标板各孔依次加入50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CdTe标记抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:/n对硝基多溴联苯进行还原后，再与牛血清白蛋白进行偶联，制成多溴联苯抗原，最后对多溴联苯抗原进行动物免疫实验，制得多溴联苯抗体；/n向CdTe量子点溶液中加入交联剂，并静置，然后再向其中加入多溴联苯抗体，于3-5℃反应40-60h，用磷酸盐缓冲溶液透析后，制得CdTe标记抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种CdTe标记抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
对硝基多溴联苯进行还原后，再与牛血清白蛋白进行偶联，制成多溴联苯抗原，最后对多溴联苯抗原进行动物免疫实验，制得多溴联苯抗体；
向CdTe量子点溶液中加入交联剂，并静置，然后再向其中加入多溴联苯抗体，于3-5℃反应40-60h，用磷酸盐缓冲溶液透析后，制得CdTe标记抗体。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述多溴联苯抗原的制备具体为使半抗原、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在N,N-二甲基甲酰胺搅拌反应6-10h，在3-5℃过夜，然后将反应产物离心分离得到上清液，与牛血清白蛋白在pH值为7-8的磷酸盐缓冲溶液中，冰浴条件下反应3-5h，之后使用生理盐水透析5-7d，得到多溴联苯抗原，其中半抗原、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和牛血清白蛋白的摩尔比为1:0.5-1:0.5-1:0.5-1；
所述动物免疫实验为选择成年健康雄性新西兰白兔，将多溴联苯抗原经过与弗氏完全佐剂充分混合后，对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫,经过加强免疫后，采用试管法和双白琼脂扩散试验考察其抗血清效价，获得多溴联苯抗体，其中多溴联苯抗原和弗氏完全佐剂的摩尔比是1:0.5-1。


3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述CdTe量子点溶液的摩尔浓度为1×10-3-2×10-3mol/L；多溴联苯抗体的浓度为0.5-2.0g/L；
CdTe量子点溶液、多溴联苯抗体和交联剂的体积比为5-10:10-20:0.5-1；
优选地，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的混合溶液，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的体积比为1:(0.5-2)，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的摩尔浓度均为0.05-0.2mol/L。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，CdTe量子点溶液中CdTe量子点的制备方法，包括如下步骤：将CdCl2·2.5H2O和巯基乙酸在惰性气氛下溶于水中，调节pH值至11.5-12.5，然后加入NaHTe溶液，控制CdCl2·2.5H2O、NaHTe溶液和巯基乙酸的比例为0.05-0.1g:50-100μL:50-100μL，得到CdTe量子点前躯体；
将所述的CdTe量子点前驱体于140-160℃加热5-60min后，在依次进行冷却、洗涤和离心，制得CdTe量子点。


5.权利要求1-4所述的任一项所述的制备方法制得的CdTe标记抗体在检测四氯联苯中的应用。


6.一种利用权利要求1-4所述的任一项所述的制备方法制得的CdTe标记抗体检测多溴联苯的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金艳，魏益华，熊艳，赖艳，邱素艳，刘廷强，陈庆隆，严寒，昌晓宇，庄惠生，
申请(专利权)人：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，
类型：发明
国别省市：江西;36