一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法技术

本发明专利技术公开了一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，特点是包括以下步骤：(1)将5～10万个精子加入500μL含有钼酸铵、曲拉通的盐酸缓冲液，混匀30秒后加入罗丹明6G和吖啶橙染色液；(2)流式细胞仪上机检测，收集绿、黄、红等三色发射荧光信号；(3)结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况，优点是实现了一次性流式细胞术检测活动精子DNA碎片情况，且简单、高效。

A flow cytometry method for the detection of DNA fragments of motile sperm

【技术实现步骤摘要】
一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法
本专利技术涉及体外诊断试剂领域，尤其是涉及一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法。
技术介绍
受精过程中，精子贡献了一半的遗传物质DNA。精子DNA完整性可影响精子受精能力、受精后原核的形成、胚胎着床、胚胎发育及子代的健康，精子DNA碎片化指数(DNAfragmentationindex，DFI)已经成为评估男性生育力的重要指标。传统方法是检测了所有精子的DFI，即包括死精子、不活动精子和活动精子的DFI混合情况。无论是自然受孕，还是辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology，ART)治疗过程中，只有活动的精子才被分选出来和应用于受精，故理论上活动精子DFI才是隐藏的、被忽视的重点。精子的活动与精子尾部有关，精子运动靠着精子尾部鞭毛摆动产生动力。目前认为精子运动是按照滑动模式进行的。其基本原理是：动力蛋白水解ATP(三磷酸腺苷)驱动临近微管间的相对滑动。精子尾部鞭毛中动力蛋白ATPase(三磷酸腺苷酶)以ATP作为底物，通过水解ATP成为ADP(二磷酸腺苷)和pi(磷酸)而获得能量，促使鞭毛轴丝中的双联微管中A微管的两行支臂，不断脱离并重新依附于相邻双微管中B微管上连续结合的位点，从而产生双联微管间的滑动并产生一个纵向力；与双联微管有关的各种附属结构形成的滑动抗力，使由支臂产生的纵向力转化为横向弯曲动力，引起浪状波的形成和传播。换句话说，通过检测精子尾部ATP降解成为ADP和pi的情况，可从根源上检测和反应活动精子情况。>
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简便、高效地检测和区分活动精子和非活动精子的DNA碎片情况的活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，包括以下步骤：(1)将精液中5～10万个精子加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集精子的绿(530nm)色、黄(556nm)色和红(640nm)色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况。步骤(1)所述的酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸(HCl)、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠(NaCl)、0.1％Triton-X100(曲拉通)，溶剂为水。主要成分为曲拉通、盐酸、钼酸铵，目的是：A、促使细胞膜通透性增加，使染料容易进入精子细胞；B、提供酸环境便于磷钼杂多酸与罗丹明6G形成缔合物；C、使紧密的DNA变得结构较为松散，以便于吖啶橙染色；D、酸可以固定细胞，阻抑了荧光染料与细胞其他成分如蛋白质、多糖和细胞膜等结合，降低背景信号。步骤(1)所述的染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水。优先的，步骤(1)所述的染色液的配方为60mmol/L罗丹明6G、6μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术公开了一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，通过检测精子动力蛋白水解ATP产生的Pi(磷酸)，以及精子DNA碎片酸化处理后产生的单链DNA来实现，精子中pi情况可采用流式细胞术法来检测：运动的精子，其动力蛋白ATP酶水解ATP产生的Pi，Pi与加入的钼酸铵反应产生磷钼杂多酸，与加入的罗丹明6G(R6G)荧光探针结合形成缔合物，该缔合物能被激发出的荧光强度大大下降；而精子细胞中未结合的R6G具有非常高的耐光性，高量子产率，低损耗，最大激发波长为530nm，激发波长范围从555nm至585nm，其最大波长为556nm，从而可通过流式细胞仪激发(激发波长Ex＝530nm)和产生荧光(发射波长Em＝556nm)来定量检测，根据荧光情况区分活动精子(缔合物多荧光弱)和非活动精子(未结合的R6G多荧光强)。精子DNA碎片情况可采用吖啶橙染色后流式细胞仪检测：吖啶橙是一种极灵敏的荧光染料，它可以与精子细胞中双链DNA和单链DNA同时染色而显示不同颜色(波长)的荧光，其激发波长峰为492nm，发射荧光波长峰为530nm(双链DNA)和640nm(单链DNA)，从而可通过流式细胞仪识别检测荧光颜色和计算DNA碎片情况。综上所述，本专利技术一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，通过对精子样本进行处理、染色，荧光标记、流式上机检测活动精子中Pi和DNA碎片情况、从而评估活动精子的DNA损伤程度，为不育症检查、辅助生殖治疗方案的选择提供帮助。该方法避免了传统方法不能区分活动和非活动精子DNA碎片情况，实现了一次性完成活动精子DNA碎片检测的简单、高效的目的。附图说明图1为精子细胞群图形，图中用圈中区域(方框内)即为精子细胞主群；图2为精子细胞群黄色荧光表达图，图中分为二群细胞，横轴上左峰(实线杠区间内)即为活动精子，横轴上的右峰(虚线杠区间内)为非活动精子细胞群。图3为精子细胞群绿色和红色荧光表达图，图中分为二群细胞，靠近纵轴的群(三角框内的为绿色)为DNA完整性好的细胞群，靠近横轴的细胞群(三角框内右侧下方的为红色)为DNA碎片化的细胞群。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。具体实施例一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，包括以下步骤：(1)将20份精液自然液化后，于37℃温度下，采用MAKLER精子计数板检测精子浓度和活动精子比率(结果见下表1)；(2)采用移液器将5-10万个精子加入500μL含有钼酸铵的酸化处理缓冲液，充分混匀；其中酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸(HCl)、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠(NaCl)、0.1％Triton-X100(曲拉通)，溶剂为水；(3)混匀，置冰上30秒后加入10μL含有罗丹明6G和吖啶橙的染色液，5-30分钟内上机检测；其中染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水；(4)清空Calibur流式细胞仪废液桶，断本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)将精液中5～10万个精子加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；/n(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集精子的绿色、黄色和红色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；/n(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况。/n

【技术特征摘要】
1.一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将精液中5～10万个精子加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；
(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集精子的绿色、黄色和红色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；
(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况。


2.根据权利要求1所述的一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的酸化处理缓冲液的配方为80-...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾桥，胡西陵，
申请(专利权)人：浙江星博生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33