非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒。本发明专利技术的检测组合物是利用锁核酸的特点设计，对DNA有强大的识别能力和亲和力，能够有效提高非洲猪瘟病毒野毒株的检测效率，降低漏检的概率。本发明专利技术为非洲猪瘟病毒野毒株鉴定检测提供了一种新的检测方法和检测试剂，与现有的检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，比常规TaqMan探针荧光定量PCR方法的灵敏度高10倍；可用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360‑505R基因缺失的疫苗株，特别适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。

Detection composition, detection method and detection kit of cfqpcr for African classical swine fever virus field strain

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFvirus，ASFV)引起的家猪和野猪的一种急性、烈性和高度接触性传染病，家猪急性感染死亡率可达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。专利“基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用”(公开号：CN110093324A)已公布了非洲猪瘟Pig/CN/HLJ/2018中国流行株MGF360-505R基因缺失或CD2V与MGF360-505R基因联合缺失均能提供100％免疫保护，社会应用价值极大。但该疫苗使用后，现有常规检测方法将无法区分野毒感染阳性和疫苗接种阳性。基于MGF360-505R基因的检测方法可作为非洲猪瘟病毒野毒株的检测方法，用于区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株。目前ASF实验室检测方法主要包括病毒分离、ELISA、PCR等。病毒分离和ELISA操作繁琐，实验条件严苛，很难在条件一般的实验室开展。荧光定量PCR已在ASFV检测中广泛应用，但其存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，现有常规TaqMan探针荧光定量PCR检测方法仍有待进一步改进，应用改良的探针设计策略已成为核酸检测方法的新方向。锁核酸(LNA)探针，是在TaqMan探针基础上选择性地将探针中的一些碱基修饰成LNA碱基，极大提高了探针与目标序列的亲和力，稳定性、特异性和灵敏度更高。应用锁核酸探针荧光定量PCR检测MGF360-505R基因，将为非洲猪瘟病毒野毒株的检测提供更加特异和灵敏的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物。本专利技术的另一目的在于提供包含上述检测组合物的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供基于上述检测试剂盒的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测方法。本专利技术的目的通过下列技术方案实现：一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物，包括用于扩增非洲猪瘟病毒野毒株的1组特异性引物对和1条在引物对的扩增靶标区域内的LNA-Taqman探针。所述的特异性引物对的序列如SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示。所述的LNA-Taqman探针的序列如SeqIDNo.3所示。所述的LNA-Taqman探针的序列中，第11位的碱基“T”、第12位的碱基“C”和第13位的碱基“C”均为锁核酸。所述的LNA-Taqman探针在5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质。所述的5′端标记荧光物质为标记FAM。所述的3′端标记淬灭物质为标记BHQ1。上述非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物在制备非洲猪瘟病毒野毒株检测试剂盒中的应用。一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒，包含上述检测组合物。所述的检测试剂盒还包含阳性对照。所述的阳性对照为包含非洲猪瘟病毒野毒株的MGF360-505R基因的重组质粒。所述的重组质粒的载体为pUC57。上述非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒在鉴定和/或检测非洲猪瘟病毒野毒株中的应用。一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：(1)提取样品的基因组DNA；(2)配制锁核酸探针荧光定量PCR反应体系；(3)将步骤(2)中配制的锁核酸探针荧光定量PCR反应体系置于荧光定量PCR仪中，进行扩增反应；(4)将基因组DNA的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到基因组DNA中非洲猪瘟病毒基因片段拷贝浓度。步骤(2)中所述的锁核酸探针荧光定量PCR反应体系为：PremixExTag(2×)10μL、浓度为10μmol/L的上游引物0.4μL(体系中浓度为0.2μmol/L)、浓度为10μmol/L的下游引物0.4μL(体系中浓度为0.2μmol/L)、浓度为10μmol/L的探针0.2μL(体系中浓度为0.1μmol/L)、模板DNA1μL、灭菌水加至20μL。所述的上游引物、下游引物和探针的序列依次如SeqIDNo.1、SeqIDNo.2和SeqIDNo.3所示。步骤(3)中所述的扩增反应的反应条件为：预变性95℃、10min；95℃、15s，60℃、30s，扩增45个循环。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术的非洲猪瘟病毒野毒株的检测组合物是利用锁核酸的特点设计，对DNA有强大的识别能力和亲和力，能够有效提高非洲猪瘟病毒野毒株的检测效率，降低漏检的概率。(2)本专利技术的检测组合物、检测试剂盒及检测方法与现有的检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，比常规TaqMan探针荧光定量PCR方法的灵敏度高10倍，适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。(3)本专利技术基于MGF360-505R基因的非洲猪瘟病毒野毒株检测组合物、检测试剂盒及检测方法可用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失的疫苗株。附图说明图1是LNATaqMan探针和TaqMan探针荧光定量PCR的灵敏性检测结果图；其中，A为LNA探针扩增曲线；B为TaqMan探针扩增曲线；1为5.7×107拷贝，2为5.7×106拷贝，3为5.7×105拷贝，4为5.7×104拷贝，5为5.7×103拷贝，6为5.7×102拷贝，7为5.7×101拷贝，8为5.7×100拷贝。图2是特异性检测结果图；其中，1为非洲猪瘟病毒阳性重组质粒pUC57-ASFV-MGF360-505R(5.7×105拷贝)；2为猪瘟病毒；3为猪圆环病毒2型；4为猪伪狂犬病毒；5为阴性对照。图3是阳性重组质粒pUC57-ASFV-MGF360-505R(5.7×105拷贝)的重复性检测结果图。具体实施方式下面将结合实施方式和附图对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。材料、方法与结果1.病毒株猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒均采购自市场上的商品化疫苗，其中，猪瘟病毒活疫苗购自广东永顺生物制药股份有限公司，猪伪狂犬病毒活疫苗(Bartha-K61株)、猪圆环病毒2型灭活疫苗购自上海海利生物技术有限公司。2.主要试剂与仪器2×PremixExTag(ProbeqP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物，其特征在于包括用于扩增非洲猪瘟病毒野毒株的1组特异性引物对和1条LNA-Taqman探针：/n所述的特异性引物对的序列如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示；/n所述的LNA-Taqman探针的序列如Seq ID No.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物，其特征在于包括用于扩增非洲猪瘟病毒野毒株的1组特异性引物对和1条LNA-Taqman探针：
所述的特异性引物对的序列如SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示；
所述的LNA-Taqman探针的序列如SeqIDNo.3所示。


2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物，其特征在于：所述的LNA-Taqman探针在5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质。


3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物，其特征在于：所述的5′端标记荧光物质为标记FAM，3′端标记淬灭物质为标记BHQ1。


4.权利要求1-3任一项所述的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物在制备非洲猪瘟病毒野毒株检测试剂盒中的应用。


5.一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3任一项所述的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物。


6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：
所述的检测试剂盒还包含阳性对照；
所述的阳性对照为包含非洲猪瘟病毒野毒株的MGF360-505R基因的重组质粒。


7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，李春玲，勾红潮，孙铭飞，卞志标，蔡汝健，蒋智勇，宋帅，楚品品，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44