本发明专利技术涉及生物制药技术领域，具体涉及一种昆虫细胞培养基及其制备方法。该培养基有效成分包括氨基酸、维生素、无机盐、碳源、脂类物质和功能添加剂；其中功能添加剂包括腐胺、抗坏血酸磷酸酯镁、乙醇胺、次黄嘌呤、酵母提取物、棉籽水解物、丙酸钠、泊洛沙姆188、柠檬酸铁、柠檬酸钠、丙酮酸钠。本发明专利技术公开的培养基无血清、无蛋白，能避免添加血清带来的潜在风险及利于下游重组蛋白的纯化；同时培养基不含动物源添加物，适合生物药物的生产；本发明专利技术公开的培养基活细胞密度与细胞存活率高，蛋白表达量高，适合重组蛋白和疫苗的生产。
An insect cell culture medium and its preparation
【技术实现步骤摘要】
一种昆虫细胞培养基及其制备方法
本专利技术涉及生物制药
，具体涉及一种昆虫细胞培养基及其制备方法。
技术介绍
昆虫细胞表达系统是重组蛋白生产的一种重要表达系统，以杆状病毒为载体，昆虫细胞表达系统已经被广泛应用于重组蛋白的表达，此外，昆虫细胞表达系统还是表达病毒样颗粒疫苗的最佳系统，已成功开发了多种人用和动物用疫苗。常用的昆虫细胞有Sf-9细胞和HighFive细胞，常用于杆状病毒表达系统的重组蛋白表达。传统的商业化昆虫细胞培养基需要添加大量的血清或血清白蛋白用于辅助细胞生长。但培养基添加血清存在血清价格昂贵、易被支原体及病毒污染、血清批次不一致等缺点；此外血清中含有大量的蛋白质不利于重组蛋白的下游分离纯化，造成重组蛋白的回收率和纯度较低，不能满足下游的需求。总体而言，培养基添加蛋白成分，一方面增加培养基成本，另外一方面给下游蛋白纯化带来困难，用无血清无蛋白培养基培养昆虫细胞成为规模化培养的趋势。目前虽然已经开发出一些用于培养昆虫细胞的无血清培养基，但这些培养基往往添加有蛋白成分，导致成本过高，下游蛋白纯化困难，并且不能适用于昆虫细胞的悬浮培养基。申请公布号为CN105255811A、CN106434526A的专利技术专利公布了一种适合昆虫细胞生长的无血清无动物源培养基添加物的制备方法，但培养基含有重组胰岛素蛋白，增加培养基成本并且为下游的重组蛋白的纯化带来困难。申请公布号为CN101988047A的培养基不适用于细胞悬浮培养，且培养的细胞密度低。公开号为CN1498267A所述培养基含有大量进口的水解乳白蛋白和酵母提取物，显著的提高了成本。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种支持昆虫细胞高密度生长、蛋白表达量高的无血清无蛋白无动物源添加物的昆虫细胞培养基。同时，本专利技术还在于提供一种昆虫细胞培养基的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种昆虫细胞培养基，其有效成分包括氨基酸、维生素、无机盐、碳源、脂类物质和功能添加剂；其中功能添加剂包括腐胺、抗坏血酸磷酸酯镁、乙醇胺、次黄嘌呤、酵母提取物、棉籽水解物、丙酸钠、泊洛沙姆188、柠檬酸铁、柠檬酸钠、丙酮酸钠。可选的，上述培养基中功能添加剂各组分的浓度为：腐胺0.15～0.6mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁0.5～3mg/L、乙醇胺3.5～10.0mg/L、次黄嘌呤3.5～10.5mg/L、酵母提取物3000～8000mg/L、棉籽水解物1000～3000mg/L、丙酸钠90～900mg/L、泊洛沙姆1881000～2500mg/L、柠檬酸铁50～150mg/L、柠檬酸钠70～200mg/L、丙酮酸钠600～1800mg/L。可选的，上述培养基中氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、精氨酸盐酸盐、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸。亮氨酸、赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸二钠盐、缬氨酸、β-丙氨酸；进一步的，培养基中氨基酸各组分的质量体积浓度为：甘氨酸250～650mg/L、丙氨酸150～370mg/L、精氨酸盐酸盐400～885mg/L、天冬酰胺150～600mg/L、天冬氨酸150～600mg/L、半胱氨酸20～75mg/L、谷氨酸200～600mg/L、谷氨酰胺300～800mg/L、组氨酸1500～3500mg/L、异亮氨酸20～75mg/L、亮氨酸50～150mg/L、赖氨酸盐酸盐350～850mg/L、蛋氨酸25～75mg/L、苯丙氨酸100～175mg/L、脯氨酸250～400mg/L、丝氨酸450～600mg/L、苏氨酸100～250mg/L、色氨酸50～150mg/L、酪氨酸二钠盐30～80mg/L、缬氨酸70～150mg/L、β-丙氨酸150～300mg/L。可选的，上述培养基中维生素包括维生素H、D-泛酸钙、叶酸、烟酸、对氨基苯酸、维生素B6、维生素B2、维生素B1、i-肌醇、硫辛酸、维生素B12、烟酰胺、维生素C、维生素E、氯化胆碱；进一步的，培养基中维生素各组分的质量体积浓度为：维生素H0.02～0.08mg/L、D-泛酸钙0.3～1.0mg/L、叶酸0.03～0.1mg/L、烟酸0.03～0.1mg/L、对氨基苯酸0.03～0.1mg/L、、维生素B60.03～0.1mg/L、维生素B20.03～0.1mg/L、维生素B10.03～0.1mg/L、i-肌醇0.03～0.1mg/L、硫辛酸0.2～0.6mg/L、维生素B120.03～0.1mg/L、烟酰胺0.03～0.1mg/L、维生素C0.03～0.1mg/L、维生素E0.025～0.08mg/L、氯化胆碱0.3～1.0mg/L。可选的，上述培养基中无机盐包括KCl、NaHCO3、MgCl2、MgSO4、MgCl2、CaCl2、NaH2PO4；进一步的，培养基中无机盐各组分的质量体积浓度为：KCl1500～3000mg/L、NaHCO3200～600mg/L、MgCl2800～1500mg/L、MgSO4600～1800mg/L、CaCl2200～800mg/L、NaH2PO4500～1500mg/L。可选的，上述培养基中碳源包括海藻糖、蔗糖、琥珀酸、富马酸、果糖、D-葡萄糖、α-酮戊二酸；上述培养基中碳源各组分的质量体积浓度为：海藻糖50～150mg/L、蔗糖10000～35000mg/L、琥珀酸500～1000mg/L、富马酸25～80mg/L、果糖200～800mg/L、D-葡萄糖200～1000mg/L、α-酮戊二酸200～800mg/L。可选的，上述培养基中脂类物质包括亚麻酸、孕酮、亚油酸、胆固醇、花生四烯酸；其中培养基中脂类物质各组分的质量体积浓度为：亚麻酸0.03～0.1mg/L、孕酮0.03～0.1mg/L、亚油酸0.04～0.24mg/L、胆固醇2～7.5mg/L、花生四烯酸0.001～0.008mg/L。上述培养基能够应用于昆虫细胞悬浮培养，在合适的生长条件下(27℃，100rpm)培养细胞6-8天。相比传统和市售昆虫细胞培养基，本专利技术昆虫细胞培养基，以腐胺、抗坏血酸磷酸酯镁、乙醇胺、次黄嘌呤、酵母提取物、棉籽水解物、丙酸钠、泊洛沙姆188、柠檬酸铁、柠檬酸钠、丙酮酸钠作为复配的功能添加剂，各功能添加剂相互之间协同配合作用，并与培养基中的氨基酸、维生素、无机盐、脂类物质和碳源相互补充和配合作用，提高培养基在应用于昆虫细胞悬浮培养过程中细胞存活率、活细胞密度和蛋白表达量；进一步的，本专利技术培养基中包括多组分复配的氨基酸、多组分复配的维生素、多组分复配的碳源、多组分复配的脂类物质、多组分复配的无机盐和多组分复配的碳源，并进一步优化各组分的浓度含量，平衡各组分在培养基中发挥的功效(尤其是复配的氨基酸、复配的维生素、复配的脂类物质和复配的碳源)，使各组分相互直接能够发挥协同增效作用，在培养基中不含有血清、蛋白和动物源添加剂的情况下进一步提高培养基在昆虫细胞悬浮培养应用过程中细胞存活率、活细胞密度和蛋白表达量本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种昆虫细胞培养基，其特征在于，其有效成分包括氨基酸、维生素、无机盐、碳源、脂类物质和功能添加剂；其中功能添加剂包括腐胺、抗坏血酸磷酸酯镁、乙醇胺、次黄嘌呤、酵母提取物、棉籽水解物、丙酸钠、泊洛沙姆188、柠檬酸铁、柠檬酸钠、丙酮酸钠。/n
【技术特征摘要】
1.一种昆虫细胞培养基，其特征在于，其有效成分包括氨基酸、维生素、无机盐、碳源、脂类物质和功能添加剂；其中功能添加剂包括腐胺、抗坏血酸磷酸酯镁、乙醇胺、次黄嘌呤、酵母提取物、棉籽水解物、丙酸钠、泊洛沙姆188、柠檬酸铁、柠檬酸钠、丙酮酸钠。
2.如权利要求1所述的昆虫细胞培养基，其特征在于，所述功能添加剂各组分的浓度为：腐胺0.15～0.6mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁0.5～3mg/L、乙醇胺3.5～10.0mg/L、次黄嘌呤3.5～10.5mg/L、酵母提取物3000～8000mg/L、棉籽水解物1000～3000mg/L、丙酸钠90～900mg/L、泊洛沙姆1881000～2500mg/L、柠檬酸铁50～150mg/L、柠檬酸钠70～200mg/L、丙酮酸钠600～1800mg/L。
3.如权利要求2所述的昆虫细胞培养基，其特征在于，所述氨基酸的组成及各组分含量包括，甘氨酸250～650mg/L、丙氨酸150～370mg/L、精氨酸盐酸盐400～885mg/L、天冬酰胺150～600mg/L、天冬氨酸150～600mg/L、半胱氨酸20～75mg/L、谷氨酸200～600mg/L、谷氨酰胺300～800mg/L、组氨酸1500～3500mg/L、异亮氨酸20～75mg/L、亮氨酸50～150mg/L、赖氨酸盐酸盐350～850mg/L、蛋氨酸25～75mg/L、苯丙氨酸100～175mg/L、脯氨酸250～400mg/L、丝氨酸450～600mg/L、苏氨酸100～250mg/L、色氨酸50～150mg/L、酪氨酸二钠盐30～80mg/L、缬氨酸70～150mg/L、β-丙氨酸150～300mg/L。
4.如权利要求3所述的昆虫细胞培养基，其特征在于，所述维生素的组成及各组分含量包括，维生素H0.02～0.08mg/L、D-泛酸钙0.3～1.0mg/L、叶酸0.03～0.1mg/L、烟酸0.03～0.1mg/L、对氨基苯酸0.03～0.1mg/L、、维生素B60.03～0.1mg/L、维生素B20.03～0.1mg/L、维生素B10.03～0.1mg/L、i-肌醇...
【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，赵春鹏，林艳，米春柳，杨献军，
申请(专利权)人：河南普诺易生物制品研究院有限公司，新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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