近红外发光多肽自组装金纳米材料及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了近红外发光多肽自组装金纳米材料及其制备方法与应用。所述的制备方法合成工艺简单，成本低，易于工业化生产。所制得的纳米材料为组装体，多肽自主装形成中空纳米纤维状结构，稳定性好，生物毒性低，基因负载能力强，金纳米粒子以颗粒状接于纳米纤维上，具有近红外发光性质，便于可视化研究。本发明专利技术还提供了所述的纳米材料在基因转染和细胞成像方面的应用，其基因负载能力强，在质粒转染方面应用性好，可将带荧光标签的质粒用于转染细胞来研究质粒转染的效果；由于近红外发光特点，还可用于细胞成像的研究，可观察待观察物质在细胞内的分布情况及进出细胞过程，在生物工程及基因治疗方面都具有重要意义。

The preparation and application of gold nanomaterials based on the self-assembly of Near-infrared Luminescent polypeptide

【技术实现步骤摘要】
近红外发光多肽自组装金纳米材料及其制备方法与应用
本专利技术属于功能光学纳米材料领域，特别涉及近红外发光多肽自组装金纳米材料及其制备方法与应用。
技术介绍
基因治疗是当代医学和生物学的一个新的研究领域，其通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞，从基因水平调控细胞中的缺陷基因表达或以正常基因矫正、替代缺陷基因来发挥治疗作用。为了达到理想的治疗效果，科学家一直在研究传送质粒DNA的有效途径。目前，将质粒DNA导入靶细胞的载体主要包括病毒性载体和非病毒性载体，主流的三种病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体以及腺病毒载体，其具有高转染率、持续稳定表达外源基因的特点，但也存在免疫原性、致癌性、宿主DNA插入整合等弊端，从而限制了它们的应用。而非病毒基因转染载体研究较多的是人工合成的阳离子聚合物，阳离子高分子的转染效率和分子量成正比，但分子量越高，电荷密度就越大，其相应的细胞毒性也就显著增加，这就限制了高分子量载体的使用，从而制约转染效率的提高。因此，急需开发一种生物毒性低、负载能力强、转染效率高的转染试剂来进一步推进基因治疗领域的发展。肽分子自组装已经成为分子生物学、化学、医学和材料学等学科的交汇点，它是指在适当的条件下，肽分子间通过非共价键力作用形成具有复杂有序的特定结构并具有某种特定功能的分子聚集体的过程。由天然氨基酸组成的自组装短肽具有良好的低细胞毒性，可控的降解性能，高的运载效率及细胞摄取率，同时还具有降低药物的毒副作用等优点，在纳米生物材料、药物传输释放、蛋白质及基因载体等方面应用较广。但将它作纳米载体材料用于药物或基因治疗过程中其在体内的传递情况及载体自身最终的去向鲜有报道，这是因为自组装多肽本身不具备发光性能无法实现可视化监测，且其组成主要是一些氨基酸，不易于检测，目前无法研究它自身的去向。因此，如何赋予这种具有低细胞毒性及高的负载效率的组装材料以可视化监测属性，在生物工程及基因治疗方面都具有十分重要的意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的提供了一种近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过所述的制备方法制得的近红外发光多肽自组装金纳米材料。所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料具有近红外发光性质，便于可视化研究，而其自组装多肽具有稳定性好，生物毒性低，基因负载能力强的特点。本专利技术的又一目的在于提供所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染和细胞成像方面的应用；本专利技术的纳米材料基因负载能力强，在质粒转染方面应用性较好，可将带荧光标签的质粒用于转染细胞，可观察转染细胞表达荧光蛋白的情况来研究质粒转染的效果(例如通过共聚焦显微镜)；所述纳米材料由于近红外发光特点，可用于细胞成像的研究，可观察待观察物质在细胞内的分布情况及进出细胞过程(例如通过共聚焦显微镜等)。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法，包括如下步骤：将氯金酸与自组装多肽孵育，加入还原剂静置反应，最后在90～100℃下搅拌反应，当反应液反应至棕黄色时，停止反应，然后透析去除多余的未反应物，最后超滤浓缩，即得所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料。进一步的，所述多肽结构为cyclo-(ARARARAD)-Acp-C，所述成环氨基酸包括4个L型丙氨酸(A)、3个D型精氨酸(R)和1个天冬氨酸(D)，L型氨基酸与D型氨基酸交替相接，所述环肽侧链为与天冬氨酸羧基相连的6-氨基己酸(Acp)，其末端再接半胱氨酸；其结构式如式Ⅰ所示，该多肽在水中溶解后会通过环肽分子骨架上的C＝O和N-H形成分子之间氢键网络的驱动力作用下自发进行组装：进一步的，所述的还原剂为还原型谷胱甘肽、还原型半胱氨酸、巯基聚乙二醇中的至少一种。进一步的，所述的反应液中的氯金酸与还原剂的摩尔浓度比为1:(0.5～1.5)；还原剂与自组装多肽的摩尔浓度比为(10～50):1。进一步的，所述的反应液的pH为7～12。进一步的，所述的反应的时间为8～30h。进一步的，所述的孵育的温度为25±5℃，所述的孵育的时间为30min～60min。进一步的，在所述的静置反应可调节pH至8～10，例如，可加入NaOH进行调节，可进一步优化发光情况。进一步的，所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在4℃下保存。如图1最右侧的结构示意图所示，所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的形貌为组装体，所述的多肽自主装形成中空纳米纤维状结构，金纳米粒子以颗粒状接于所述的纳米纤维上，所述的金纳米单颗粒子粒径为1.5～2.5nm，所述的纳米纤维的长度为200～600nm。进一步的，所述反应完的产物在pH为6～9的水中透析，可通过NaOH等酸碱调节剂对pH进行调节；透析时间为1～4天，所述超滤浓缩使用超滤管的膜孔径为3～50kDa。一种近红外发光多肽自组装金纳米材料，通过所述的制备方法制得。所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染和/或细胞成像方面的应用。所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染方面的应用，包括负载质粒DNA转染细胞，具体方法为：将所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料与质粒DNA混合，涡旋后静置得到混合物，将所述的混合物加入40％～60％的细胞密度的待转染细胞中，加入无血清培养基培养进行转染后，吸走培养液，改用含血清的培养基培养进行细胞表达，最后观察细胞荧光蛋白的表达情况。进一步的，所述的观察细胞荧光蛋白的表达情况可通过本领域常用的技术手段进行观察，例如共聚焦显微镜等。进一步的，所述质粒可以为带荧光蛋白表达的质粒，可通过共聚焦成像系统对转染效果进行观察；更进一步的，所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白。进一步的，所述近红外发光的多肽自组装金纳米材料使用的浓度为20nM～150nM，质粒DNA用量为1～3μg/mL，转染时间为6～12h，细胞表达时间24～72h。进一步的，所述的静置的时间为20～40min。进一步的，所述待转染细胞为Hela细胞，而不仅限于Hela细胞。所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在细胞成像方面的应用，例如，可应用于待观察物质进出细胞的成像中，例如，待观察物质的内吞过程、排出过程等，所述的待观察物质可以是所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料，或质粒DNA负载于所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料后形成的物质。其中，待观察物质的内吞过程成像及定量检测的具体方法包括以下步骤：将接种有细胞密度为20％～30％的细胞培养24h后，用DMEM洗涤两次后，加入待观察物质，在无血清培养基中培养不同的时间后，观察待观察物质在细胞内的成像情况，或检测细胞内吞待观察物质的含量变化情况。其中，所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的排出过程成像及定量检测的具体方法包括以下步骤：将接种有细胞密度为20％～30％的细胞培养24h后，用DMEM洗涤两次后，加入所述的近红外发光多肽自组装金纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n将氯金酸与自组装多肽孵育，加入还原剂静置反应，最后在90～100℃下搅拌反应，当反应液反应至棕黄色时，停止反应，然后透析去除多余的未反应物，最后超滤浓缩，即得所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料。/n

【技术特征摘要】
1.一种近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将氯金酸与自组装多肽孵育，加入还原剂静置反应，最后在90～100℃下搅拌反应，当反应液反应至棕黄色时，停止反应，然后透析去除多余的未反应物，最后超滤浓缩，即得所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料。


2.根据权利要求1所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法，其特征在于：
所述多肽结构为cyclo-(ARARARAD)-Acp-C，所述环肽侧链为与天冬氨酸羧基相连的6-氨基己酸，其末端再接半胱氨酸，其结构式如式Ⅰ所示：





3.根据权利要求1所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法，其特征在于：
所述的还原剂为还原型谷胱甘肽、还原型半胱氨酸、巯基聚乙二醇中的至少一种；
所述的反应液中的氯金酸与还原剂的摩尔浓度比为1:(0.5～1.5)；还原剂与自组装多肽的摩尔浓度比为(10～50):1；
所述的反应液的pH为7～12；
所述的反应的时间为8～30h；
所述的孵育的温度为25±5℃；
所述的孵育的时间为30min～60min；
在所述的静置反应的pH为8～10。


4.根据权利要求1～3任一项所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的制备方法，其特征在于：
所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料的形貌为组装体，所述的多肽自主装形成中空纳米纤维状结构，金纳米粒子以颗粒状接于所述的纳米纤维上，所述的金纳米单颗粒子粒径为1.5～2.5nm，所述的纳米纤维的长度为200～600nm；
所述反应完的产物在pH为6～9的水中透析，透析时间为1～4天，所述超滤浓缩使用超滤管的膜孔径为3～50kDa。


5.一种近红外发光多肽自组装金纳米材料，其特征在于：
通过权利要求1～4任一项所述的制备方法制得。


6.权利要求1～4任一项所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染和/或细胞成像方面的应用。


7.根据权利要求6所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染和/或细胞成像方面的应用，其特征在于：
所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料在基因转染方面的应用，包括负载质粒DNA转染细胞，具体方法为：将所述的近红外发光多肽自组装金纳米材料与质粒DNA混合，涡旋后静置得到混合物，将所述的混合物加入40％～60％的细胞密度的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘锦斌，何魁，黄柏浩，梁华润，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44