一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法技术

一种COVID‑19‑S‑RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，用CuMV

A covid-19-s-rbd virus like particle, vaccine and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，属于生物医药

技术介绍
2019新型冠状病毒(COVID-19)的症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。该病毒已确认存在人传人现象，且潜伏期具有传染性，所致疾病没有特异治疗方法。但是不同形式的疫苗正在研发，新闻报道的比如2020年2月25日，专注于mRNA药物和疫苗研发的临床阶段的生物技术公司Moderna宣布，已经生产了第一批供人体试验使用的新型冠状病毒的疫苗mRNA-1273。还有2020年2月25日天津大生命科学学院黄金海教授团队宣布已经研发出新型冠状病毒口服疫苗，该疫苗以食品级安全酿酒酵母为载体，以新型冠状病毒S蛋白为靶点产生抗体。目前科研团队正在寻求合作方，希望能推动疫苗早日走向临床，为疫情防控发挥作用。病毒样颗粒(VirusLikeParticle，VLP)疫苗的发展为如何研发既保持构象表位并且无毒力回复风险的疫苗提供了一种新的研究策略。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白天然的自装配能力，可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保持了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。cVLP通过基因融合表达或以VLP为载体通过化学偶联的方法将外源抗原与其偶联制备而成，后一种方法制备的重组VLP也常被称作偶联VLP。融合表达的方法如下，在制备无包膜VLP的基础上，将外源抗原DNA与具有自我组装能力的多肽基因融合，进一步制备无包膜cVLP；类似于有包膜VLP的制备方法，将不同种(型)的病毒蛋白或嵌合蛋白组合，形成cVLP(包膜型或无包膜型)。但是嵌合疫苗产量比较低，生产成本比较高，且在大规模生产时，易导致产品结构和组分上不相容，限制了其在疫苗中的发展。化学偶联方法是依靠模块化系统，分别合成VLP和靶抗原，在体外以共价键或非共价键结合的形式，将抗原与预装配的VLP相连。其优势在于靶抗原的大小和结构不受VLP单体折叠和颗粒组装等条件的限制，可以在VLP表面展示短线性肽、肽环和全长蛋白，甚至多糖和半抗原等非蛋白形式的抗原。瑞士Cytos生物制药公司将尼古丁共价偶联与噬菌体QβVLP表面，制备戒烟疫苗，Ⅰ/Ⅱ期临床评估结果表明，尼古丁-QβcVLP可以诱导高滴度尼古丁特异性抗体。并且单独的病毒样颗粒可以在大肠杆菌中稳定表达，提高了产量的同时降低了成本。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的不足，提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，易于通过菌体培养获得，连接效率高，比嵌合表达产量高，便于工业化生产,免疫反应快。本专利技术的第一个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的pET28a-CuMVTT重组质粒通过表达菌株表达获得。作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内切酶和BamHⅠ内切酶双酶切后，再用T4DNA连接酶将CuMVTT和pET28a质粒双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组质粒。作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述表达菌株采用大肠杆菌T7Shuffle表达菌株。用50ug/ml浓度的卡那霉素筛选得到pET28a-CuMVTTT7Shuffle重组表达菌株。本专利技术通过构建并培养能够表达CuMVTT病毒样颗粒的大肠杆菌重组表达菌株，成功的获得了一种易于通过菌体培养获得，适合工业化生产，且便于纯化的CuMVTT病毒样颗粒。作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得。本专利技术的第二个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD疫苗，包括上述的CuMVTT病毒样颗粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成的pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD蛋白。所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗。本专利技术通过一定浓度的CuMVTT病毒样颗粒与一定量的COVID-2019-S-RBD蛋白在特定条件下通过化学偶联试剂SMPH偶联成COVID-2019-S-RBD-CuMVTT，适合工业化生产，且便于纯化。作为COVID-19-S-RBD疫苗的优选方案，所述表达细胞株采用293F表达细胞株，所述pFUSE-COVID-2019-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获得pFUSE-COVID-2019-S-RBD重组表达细胞株。本专利技术通过构建并培养能够表达COVID-2019-S-RBD蛋白的293F细胞重组表达细胞株，成功的获得了一种易于通过哺乳细胞培养获得，适合工业化生产，且便于纯化COVID-2019-S-RBD蛋白。作为COVID-19-S-RBD疫苗的优选方案，所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒是将COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒均用EcoRⅠ内切酶和BgⅢ内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒双酶切产物连接得到。本专利技术的第三个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：(11)重组质粒的构建：用黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后构建pET28a-CuMVTT重组质粒；(12)重组质粒转入表达菌株：将所述pET28a-CuMVTT重组质粒转入大肠杆菌T7Shuffle表达菌株，得到pET28a-CuMVTT重组表达菌株；(13)菌体培养及CuMVTT病毒样颗粒纯化：培养所述pET28a-CuMVTT重组表达菌株，离心分离生物质获得CuMVTT病毒样颗粒。作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法的优选方案，CuMVTT病毒样颗粒纯化是将大肠杆菌重组表达菌株培养菌液离心10min，取沉淀，然后向沉淀物中加入适量的裂解液，再离心12min，取上清，上清液经1％TritonX-100、4％PEG8000沉淀、30％蔗糖，超速离心获得CuMVTT病毒样颗粒。本专利技术的第四个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，包括以下步骤：(21)重组质粒的构建：采用COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMV

【技术特征摘要】
1.一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的pET28a-CuMVTT重组质粒通过表达菌株表达获得。


2.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内切酶和BamHⅠ内切酶双酶切后，再用T4DNA连接酶将CuMVTT基因和pET28a质粒双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组质粒。


3.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述表达菌株采用大肠杆菌T7Shuffle表达菌株。


4.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，其特征在于，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得。


5.一种COVID-19-S-RBD疫苗，其特征在于，包括如权利要求1所述的COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成的pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD蛋白；
所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗。


6.根据权利要求5所述的一种COVID-19-S-RBD疫苗，其特征在于，所述表达细胞株采用293F表达细胞株，所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获得pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株。


7.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(11)重组质粒的构建：用黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后构...

【专利技术属性】
技术研发人员：查丽莎，马丁·巴赫曼，
申请(专利权)人：山东赫兹生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37