一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，其先向待检测样品细胞中加入裂解液进行变性，所述的裂解液成分为50mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸，1％十二烷基硫酸钠,1％聚乙二醇辛基苯基醚，1％吐温20，1％乙基苯基聚乙二醇，5mM乙二胺四乙酸,50mM氯化钠,1％的丙三醇,1×蛋白酶抑制剂和5mM二硫苏糖醇，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，去除影响胰蛋白酶活性的变性剂，置换完成后对变性样品进行赖氨酸蛋白酶酶解和胰蛋白酶解，最后提取酶解样品进行色谱‑串联质谱分析，具有可实现自动化，提高不同批次实验的重复性同时提高通量的优势，同时该方法在肽段回收率，样品重复性等评价指标上均不逊于传统的蛋白质酶解方法。

A proteomic analysis method based on SP3 enzymolysis

【技术实现步骤摘要】
一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法。
技术介绍
随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究早已进入后基因组时代。在这个时代，更加着重关注基因的功能和结构，因此蛋白质组学得到了蓬勃发展。蛋白质组(Proteome)的概念最先由MarcWilkins提出，指由一个基因组(genome)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(Protein)。蛋白质组学的研究主要包括蛋白质组定性、高通量定量蛋白质组、靶向蛋白质组以及蛋白质翻译后修饰等方面的内容，传统的鸟枪法在蛋白质组学的研究应用最为广泛。该方法的主要流程是将蛋白酶通过蛋白酶酶解成肽段，再用质谱进行分析，最后通过数据分析将得到的图谱匹配上具体的肽段信息，最后对蛋白进行定性定量。因此，蛋白质酶解蛋白质组学研究中极为重要的一环，直接影响后期得到的数据。常用的蛋白酶解方法有溶液内酶解和Filter-AidedSamplePreparation(简写为FASP)，其中溶液内酶切对蛋白溶液成分有限制，常见的变性剂(例如SDS,尿素，盐酸胍)均会影响胰蛋白酶活性从而影响酶解效果；而FASP酶解步骤繁琐，耗时长，样品损失大，不利于小量样本，因此新的酶解方法的专利技术对于蛋白质组学的发展有着重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，其先向待检测样品细胞中加入裂解液进行变性，所述的裂解液成分为50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1％十二烷基硫酸钠,1％聚乙二醇辛基苯基醚，1％吐温20，1％乙基苯基聚乙二醇，5mM乙二胺四乙酸,50mM氯化钠,1％的丙三醇,1×蛋白酶抑制剂和5mM二硫苏糖醇，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，去除影响胰蛋白酶活性的变性剂，置换完成后对变性样品进行赖氨酸蛋白酶解和胰蛋白酶解，最后提取酶解样品进行色谱-串联质谱分析，具有可实现自动化，提高不同批次实验的重复性同时提高通量的优势，同时该方法在肽段回收率，样品重复性等评价指标上均不逊于传统的蛋白质酶解方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，先向待检测样品细胞中加入裂解液进行变性，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，置换完成后对变性样品进行溶液内酶解，最后提取酶解样品进行色谱-串联质谱分析；所述的裂解液的成分及各成分终浓度为50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，1％十二烷基硫酸钠(SDS),1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton100)，1％吐温20(Tween20)，1％乙基苯基聚乙二醇(NP40)，5mM乙二胺四乙酸(EDTA),50mM氯化钠(NaCl),1％(vol/vol)丙三醇(glycerol),1×蛋白酶抑制剂(cOmpleteproteaseinhibitor)和5mM二硫苏糖醇(DTT)。上述方法包括如下详细步骤：步骤S1变性细胞样品，取样品细胞并清洗干净，即将黏附在细胞上的培养基等物质冲走，向已经清洗干净的细胞样品中加入裂解液进行变性，变性完成后离心取上清液，对上清液中的蛋白质进行定量；步骤S2置换裂解液，取步骤S1中获得的蛋白样品，先加入5mM的二硫苏糖醇(DTT)还原反应40-80min，再加入10mM的碘乙酰胺(IAA)于黑暗条件下反应20-40min，再加入2.5mM的二硫苏糖醇(DTT)于黑暗下反应10-20min；再按蛋白：磁珠＝1：10的质量比例向样品中加入磁珠(beads)，同时加入无水乙醇浸没样品，将样品搅拌混匀反应，用磁力架吸附磁珠并去除上清液；步骤S3酶解，将步骤S2中获得的固体物冲洗干净，加入NH4HCO3，再加入赖氨酸蛋白酶(Lys-C)进行第一次酶解，再向固体物中添加胰蛋白酶(trypsin)进行第二次酶解，两次酶解后进行高速离心，取上清液，将上清液冷冻干燥后加入FA复溶，进行蛋白肽段定量分析；步骤S4蛋白质组学分析，取步骤S3获得的肽段溶液进行蛋白质组学分析，包括高效液相色谱分离、串联质谱分析和对样品进行图谱比对分析。根据以上方案，所述的步骤S1中的细胞清洗方式为用10mM的磷酸盐缓冲液对细胞冲洗2-5次；步骤S1中的变性过程中添加超声波辅助变性，超声波功率为200W，超声波处理方式为处理8S后间隔5S再进行第2次处理，循环8次；步骤S1中的离心为14000g离心20min。根据以上方案，所述的步骤S2中无水乙醇加入的量为添加无水乙醇至乙醇的终浓度为50％；步骤S2中的搅拌混匀反应的条件是25℃恒温中1000rpm摇晃混匀20min；步骤S2中加入二硫苏糖醇后在37℃下进行反应。根据以上方案，所述的步骤S3中的冲洗方式为用80％的乙醇冲洗2-5次，NH4HCO3浓度为25mM，所述的第一次酶解中赖氨酸蛋白酶的添加质量比例是样品蛋白：赖氨酸蛋白酶＝100：1，酶解条件为37℃恒温，1000rpm酶解4h；所述的第二次酶解中胰蛋白酶的添加质量比例是样品蛋白：胰蛋白酶＝50：1，酶解条件为37℃恒温，1000rpm酶解12-24h。根据以上方案，所述的步骤S3中的离心条件为：16000g离心20min；步骤S3中的FA溶液为0.1％FA溶液。根据以上方案，所述的步骤S4中的高效液相色谱分离是取1μg步骤S3获得的肽段溶液进行高效液相色谱分离，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈浓度为84％，流速：300nl/min，液相梯度如下：液相分离梯度如下：0min—2min，B相线性梯度从5％到8％；2min—42min，B相线性梯度从8％到23％；42min—50min，B相线性梯度从23％到40％；50min—60min，B相线性梯度从40％到100％并维持至60min；所述的色谱分析柱为25cm*75μm，填料C18为1.9um，用95％的A相进行平衡。根据以上方案，所述的步骤S4中的串联质谱分析条件是，采用正离子扫描模式，分析时长：60min，母离子扫描范围：300-1800m/z,一级质谱分辨率：60,000atm/z200，最大增益控制(AGCtarget):3e6，一级最大进样时间(MaximumIT)：25ms；二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后触发采集20个二级质谱图谱，二级质谱分辨率：15,000atm/z200，最大增益控制(AGCtarget):5e4，二级最大进样时间(MaximumIT)：25ms，MS2解离模式(MS2ActivationType):高能碰撞解离(HCD)，隔离窗口(Isolationwindow)：1.5Th，碰撞能量(Normalizedcollisionenergy)：27。本专利技术的有益效果是：将Single-pot,Solid-phase-enhancedSample-preparation(简写为SP3)酶解技术应用于蛋白质组学的样品制备中，不仅为蛋白样品制备环节提供了新的方法供选择，同时该方法在肽段回收本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，其特征在于，先向待检测样品细胞中加入裂解液进行变性，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，置换完成后对变性样品进行溶液内酶解，最后提取酶解样品进行色谱-串联质谱分析；所述的裂解液的成分及各成分终浓度为50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1％十二烷基硫酸钠,1％聚乙二醇辛基苯基醚，1％吐温20，1％乙基苯基聚乙二醇，5mM乙二胺四乙酸,50mM氯化钠,1％的丙三醇,1×蛋白酶抑制剂和5mM二硫苏糖醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，其特征在于，先向待检测样品细胞中加入裂解液进行变性，再向已经变性的样品中加入磁珠置换裂解液，置换完成后对变性样品进行溶液内酶解，最后提取酶解样品进行色谱-串联质谱分析；所述的裂解液的成分及各成分终浓度为50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1％十二烷基硫酸钠,1％聚乙二醇辛基苯基醚，1％吐温20，1％乙基苯基聚乙二醇，5mM乙二胺四乙酸,50mM氯化钠,1％的丙三醇,1×蛋白酶抑制剂和5mM二硫苏糖醇。


2.根据权利要求1所述的基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，其特征在于，包括如下详细步骤：
步骤S1变性细胞样品，取样品细胞并清洗干净，向已经清洗干净的细胞样品中加入裂解液进行变性，变性完成后离心取上清液，对上清液中的蛋白质进行定量；
步骤S2置换裂解液，取步骤S1中获得的蛋白样品，先加入5mM的二硫苏糖醇还原反应40-80min，再加入10mM的碘乙酰胺于黑暗条件下反应20-40min，再加入2.5mM的二硫苏糖醇于黑暗下反应10-20min；再按蛋白：磁珠＝1：10的质量比例向样品中加入磁珠，同时加入无水乙醇浸没样品，将样品搅拌混匀反应，用磁力架吸附磁珠并去除上清液；
步骤S3酶解，将步骤S2中获得的固体物冲洗干净，加入NH4HCO3，再加入赖氨酸蛋白酶进行第一次酶解，再向固体物中添加胰蛋白酶进行第二次酶解，两次酶解后进行高速离心，取上清液，将上清液冷冻干燥后加入FA复溶，进行蛋白肽段定量分析；
步骤S4蛋白质组学分析，取步骤S3获得的肽段溶液进行蛋白质组学分析，包括高效液相色谱分离、串联质谱分析和对样品进行图谱比对分析。


3.根据权利要求2所述的基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中的细胞清洗方式为用10mM的磷酸盐缓冲液对细胞冲洗2-5次；步骤S1中的变性过程中添加超声波辅助变性，超声波功率为200W，超声波处理方式为处理8S后间隔5S再进行第2次处理，循环8次；步骤S1中的离心为14000g离心20min。


4.根据权利要求2所述的基于SP3酶解的蛋白质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中无水乙醇加入的量为添加无水乙醇至乙醇的终浓度为50...

【专利技术属性】
技术研发人员：李嘉玲，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31