一种文心兰原生质体游离与培养方法技术

本发明专利技术提供了一种文心兰原生质体游离与培养方法，以文心兰类原球茎为起始材料，经过愈伤组织诱导培养以及4~5次继代培养获得生长旺盛、结构疏松的愈伤组织用于原生质体的游离；将愈伤组织先在4℃下冷处理1d，再放入混合酶液中，摇床振荡酶解8~10h，然后利用界面法纯化原生质体，从而获得大量高活力的文心兰原生质体；继续使用本发明专利技术培养基进行固液双层培养，获得的文心兰原生质体细胞能够正常生长，连续分裂，形成小细胞团，其分裂频率最高达到10.16%，植板率最高达到4.03%。本发明专利技术为利用文心兰原生质体进行细胞融合、体细胞杂交、遗传转化以及种质创新提供科学依据。

A method of protoplast dissociation and culture of Oncidium

【技术实现步骤摘要】
一种文心兰原生质体游离与培养方法
本专利技术属于观赏植物细胞工程领域，具体涉及一种文心兰原生质体游离与培养方法。
技术介绍
文心兰（Oncidiumhybridum）又名吉祥兰，跳舞兰、舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，为兰科文心兰属及与其近缘属间杂交种的总称，主要分布于美国、墨西哥、巴拉圭、秘鲁、巴西等中南美洲的热带和亚热带地区。文心兰是复茎性气生兰类，形态变化较大，按是否具有假鳞茎可分为具假鳞茎种和不具假鳞茎种两类，按叶的形态又可以分为薄叶种、厚叶种和剑叶种三类。文心兰的花朵从迷你型到大花型形态差异变化较大，而且色彩艳丽、花色丰富，不仅有常见的黄色和棕色，更有绿色、白色、红色、洋红色以及褐色等，或者多种颜色混杂形成斑纹或斑块。文心兰主要作为切花和盆花生产，其花分枝良好、花形优美、花色亮丽，且可连续开花，具有较高的观赏价值和较强的市场竞争力，尤其是在欧美市场中成为畅销的盆花种类之一。我国文心兰的主产地在台湾地区，产业发展迅速，但我国大陆地区文心兰种质资源匮乏，栽培品种多为国外育种公司选育的品种，缺少自主知识产权品种。与其它兰科植物相同，文心兰在自然状态下繁殖困难，种子萌发率极低，故传统栽培靠分株繁殖。但分株繁殖系数较低，通过科研工作者对文心兰优质种苗快速繁殖方法的长期探索，组织培养已经成为文心兰种苗繁殖的最好方法。杂交育种是文心兰的主要育种手段。在过去几十年里，通过杂交育种，虽然也成功地获得了一些性状优良的文心兰栽培品种，但是在新品种的登录上仍远比蝴蝶兰、石斛兰等其他兰科植物少，其主要原因是文心兰无论是属内的种间杂交还是与近缘属的属间杂交其亲和力都很差。而原生质体融合可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远缘杂交中的有性不亲和界限。通过原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建，是植物细胞工程的重要手段，它在进行品种改良和创造新种质方面都有着广阔的应用前景。植物原生质体是植物细胞去掉细胞壁后得到的由质膜包裹着的裸露细胞，它是组成细胞的一个形态结构单位，包括细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性的细胞器，是细胞生命活动的物质基础。植物原生质体为植物育种基础研究和遗传工程提供了一个方便的遗传操作实验系统。培养植物的原生质体，可研究植物细胞壁的形成，进一步培养可产生体细胞无性系，甚至可以从无性系变异体中筛选出具有优良性状的无性系；利用原生质体可以进行细胞融合和体细胞杂交，创造远源杂种，获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体，成为一种突破物种生殖隔离的新途径；原生质体又是植物基因工程的理想受体，如今也被广泛应用于信号传导、外源基因导入及瞬间表达系统等方面的研究。兰花原生质体培养和体细胞融合，是兰花细胞工程技术中大有作为的研究领域，这种技术体系为兰花育种开辟了新的途径，对兰花产业的发展有着不可估量的价值。一个有效的原生质体分离、培养体系是原生质体融合的先决条件。目前，分离原生质体的常规方法是酶解法。用酶解法分离原生质体时，除需要选择合适的分离材料外，还要选择合适的水解酶种类、组合及浓度。另外植物原生质体的分离还受到酶解时间、温度及值、分离方法及其他因素的影响。植物原生质体在分离纯化后，需要经过原生质体的培养生成再生植株。对于植物原生质体的培养受到很多因素的影响，如供体材料、培养基组成、培养方式、培养密度等。目前关于兰花原生质体分离、培养的研究主要围绕蕙兰、蝴蝶兰、石斛兰这几种，而关于文心兰原生质体的研究还未见报道。本研究在文心兰组织培养的基础上，探索多种因素对分离文心兰原生质体的产量和活力的影响，并进对分离的原生质体行培养，为文心兰植株再生、原生质体融合及遗传转化等研究奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种文心兰原生质体的游离及培养方法。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种文心兰原生质体游离与培养方法，包括以下步骤：1）愈伤组织的诱导：将文心兰类原球茎切成1~2mm小块，接种于愈伤组织诱导培养基上，置于24~26℃、黑暗条件下培养30d左右；2）愈伤组织的继代培养：将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基上进行培养，每15~20d进行选择继代，继代4~5次获得生长旺盛、结构疏松的愈伤组织用于原生质体的游离；3）原生质体的游离：将上述愈伤组织先在4℃下冷处理1d，然后取1g左右愈伤组织放入10mL混合酶液中，置于摇床上振荡酶解8~10h；4）原生质体的纯化：酶解完成后，酶解液用套筒漏斗和200目尼龙网过滤，加入CPW-13%甘露醇溶液洗涤，将滤液收集于离心管中，500r/min离心10min，弃上清，将沉淀用CPW-25%蔗糖溶液悬浮后，沿管壁缓慢在蔗糖层上面加入CPW-13%甘露醇溶液，300r/min离心3min，原生质体在蔗糖与甘露醇两液面间形成一条清晰的带，吸出原生质体带置于另一离心管中，加入液体原生质体培养基，500r/min离心10min，弃上清，获得纯化的原生质体；5）原生质体的培养：将纯化的原生质体重新用液体原生质体培养基悬浮，调整密度为1×105~3×105个/mL；取2mL固体原生质体培养基加入直径为6cm的培养皿中，凝固后加入1mL原生质体悬浮液，用Parafilm封口后，置于24~26℃、黑暗条件下培养；培养3周后添加4~6滴降压培养基，继续培养直至形成肉眼可见的多细胞团。所述步骤1）中愈伤组织诱导培养基的配方为：VW基本培养基+花宝1号3g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+阿魏酸10mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6g/L，调整培养基pH至5.8。所述步骤2）中继代培养基的配方为：VW基本培养基+花宝1号3g/L+NAA3.0mg/L+IAA2.0mg/L+6-BA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L；调整培养基pH至5.8。所述步骤2）中继代培养的条件为：温度24~26℃，光照强度为600~1000lx，光照时间为9~11h/d。所述步骤3）中混合酶液的成分为：CPW溶液+1.5%纤维素酶+0.2%果胶酶+10g/L聚乙烯吡咯烷酮+2g/L甜菜碱+0.5mol/L甘露醇，调整pH至5.6。所述步骤3）中摇床的温度为25~28℃，转速为30~50r/min。所述步骤4）中液体原生质体培养基的配方为：KNO3800~1000mg/L，CaCl2·2H2O600~800mg/L，MgSO4·7H2O630~720mg/L，KH2PO4150~160mg/L，H3BO33.2~3.8mg/L，KI0.37~0.45mg/L，Na2MoO4·2H2O0.12~0.16mg/L，CoCl2·6H2O0.015~0.020mg/L，MnSO4·4H2O13~16mg/L，ZnSO4·7H2O4.4~5.0mg/L，CuSO4·5H2O0.02~0.03mg/L，FeSO4·7H2O13.7~14.5mg/L，Na2-EDTA18.8~19.6mg/L，肌醇80~100mg/L，水解酪蛋白160~200mg/L，天门冬酰胺40~60mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种文心兰原生质体游离与培养方法，包括以下步骤：/n1）愈伤组织的诱导：将文心兰类原球茎切成1~2mm小块，接种于愈伤组织诱导培养基上，置于24~26℃、黑暗条件下培养30d左右；/n2）愈伤组织的继代培养：将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基上进行培养，每15~20d进行选择继代，继代 4~5次获得生长旺盛、结构疏松的愈伤组织用于原生质体的游离；/n3）原生质体的游离：将上述愈伤组织先在4℃下冷处理1d，然后取1g左右愈伤组织放入10mL混合酶液中，置于摇床上振荡酶解8~10h；/n4）原生质体的纯化：酶解完成后，酶解液用套筒漏斗和200目尼龙网过滤，加入CPW-13%甘露醇溶液洗涤，将滤液收集于离心管中，500r/min离心10min，弃上清，将沉淀用CPW-25%蔗糖溶液悬浮后，沿管壁缓慢在蔗糖层上面加入CPW-13%甘露醇溶液，300r/min离心3min，原生质体在蔗糖与甘露醇两液面间形成一条清晰的带，吸出原生质体带置于另一离心管中，加入液体原生质体培养基，500r/min离心10min，弃上清，获得纯化的原生质体；/n5）原生质体的培养：将纯化的原生质体重新用液体原生质体培养基悬浮，调整密度为1×10...

【技术特征摘要】
1.一种文心兰原生质体游离与培养方法，包括以下步骤：
1）愈伤组织的诱导：将文心兰类原球茎切成1~2mm小块，接种于愈伤组织诱导培养基上，置于24~26℃、黑暗条件下培养30d左右；
2）愈伤组织的继代培养：将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基上进行培养，每15~20d进行选择继代，继代4~5次获得生长旺盛、结构疏松的愈伤组织用于原生质体的游离；
3）原生质体的游离：将上述愈伤组织先在4℃下冷处理1d，然后取1g左右愈伤组织放入10mL混合酶液中，置于摇床上振荡酶解8~10h；
4）原生质体的纯化：酶解完成后，酶解液用套筒漏斗和200目尼龙网过滤，加入CPW-13%甘露醇溶液洗涤，将滤液收集于离心管中，500r/min离心10min，弃上清，将沉淀用CPW-25%蔗糖溶液悬浮后，沿管壁缓慢在蔗糖层上面加入CPW-13%甘露醇溶液，300r/min离心3min，原生质体在蔗糖与甘露醇两液面间形成一条清晰的带，吸出原生质体带置于另一离心管中，加入液体原生质体培养基，500r/min离心10min，弃上清，获得纯化的原生质体；
5）原生质体的培养：将纯化的原生质体重新用液体原生质体培养基悬浮，调整密度为1×105~3×105个/mL；取2mL固体原生质体培养基加入直径为6cm的培养皿中，凝固后加入1mL原生质体悬浮液，用Parafilm封口后，置于24~26℃、黑暗条件下培养；培养3周后添加4~6滴降压培养基，继续培养直至形成肉眼可见的多细胞团。


2.根据权利要求1所述的一种文心兰原生质体游离与培养方法，其特征在于，所述步骤1）中愈伤组织诱导培养基的配方为：VW基本培养基+花宝1号3g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+阿魏酸10mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6g/L，调整培养基pH至5.8。


3.根据权利要求1所述的一种文心兰原生质体游离与培养方法，其特征在于，所述步骤2）中继代培养基的配方为：VW基本培养基+花宝1号3g/L+NAA3.0mg/L+IAA2.0mg/L+6-BA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L；调整培养基pH至5.8。


4.根据权利要求1所述的一种文心兰原生质体游离与培养方法，其特征在于，所述步骤2）中继代培养的条件为：温度24~26℃，光照强度为600~1000lx，光照时间为9~11h/d。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊敏，
申请(专利权)人：陈俊敏，
类型：发明
国别省市：云南;53