一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法。将基因工程稻谷粉碎后与提取缓冲液混合提取后过滤，得到含重组人纤维连接蛋白的粗提液；将含重组人纤维连接蛋白的粗提液经过阳离子交换层析，进行初级分离纯化，获得含重组人纤维连接蛋白的初级产物；将初级产物经过阴离子交换层析，进行末级分离纯化，获得重组人纤维连接蛋白目标物。该方法成本低，易于工业化放大。所获得的OsrhFn目标物SEC‑HPLC纯度大于95％。生物活性较好。

A method for isolation and purification of recombinant human fibronectin from genetically engineered rice seeds

【技术实现步骤摘要】
一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法。
技术介绍
纤维连接蛋白(Fibronectin，Fn)，也做纤维结合蛋白，是一种分布极为广泛的高分子量糖蛋白。存在于血浆、细胞胞内物质及不同细胞表面中，它通常以分子量为450kD左右的二聚体形式存在，单体分子量为220-250kD，由位于蛋白质羧基端的二硫键相连。纤维连接蛋白大多以可溶的形式存在于血浆等体液中，以不可溶的形式存在于细胞外基质中。它具有与细胞外基质蛋白如胶原、循环血液蛋白如血纤蛋白、糖胺聚糖如肝素等物质的结合，因此，在很多重要的生理过程如胚胎发育、伤口愈合、止血和凝血中都发挥着重要的作用。早期从组织中纯化Fn的方法多为冷沉淀法，Fn与一些杂蛋白在4℃以下静置时会以沉淀形式析出，之后再以沉淀和离子交换层析等方法进一步纯化；从培养纤维原表面分离Fn蛋白则采用低浓尿素的提取方法；而Anti-Fn介质则可广泛地应用于血浆及细胞培养物中Fn的纯化。但这些方法都逐渐以亲和层析所取代，原理是基于它与变性胶原蛋白(通常为明胶)的高特异亲和性的结合，然后以1molLKBr、1-8molL尿素或胺盐洗脱。纤维连接蛋白在血浆中的含量极为丰富，约为300mg/L，因此血浆是获得Fn的一个主要来源。国外生产的Fn产品都是从人血浆中提取的,作为化妆品添加剂并可用于药物中治疗创伤、烧伤、休克等，具有重大的社会效益及经济价值，但血浆来源有限，且生产工艺复杂，不利于规模化放大。r>
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法。为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法，依次包括以下步骤：1)从重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液；2)将含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物；3)将初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人纤维连接蛋白。步骤1)中以重组人纤维连接蛋白基因工程水稻种子为原料，将稻谷脱壳抛光成半精米，并研磨成80-100目的米粉；将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得粗蛋白提取物；所述提取缓冲液为：0-50mMTris、0-50mMPB，0-110mMNaCl，pH5.9-8.0；优选的提取组分中可添加0.8-1mMPMSF或5-10mMGSH或0.05-0.1％Tween80中的一种或数种。步骤2)中阳离子交换层析的填料选自NanoGel30/50SP、UniGel30/80SP、SPBestaroseFF、SPBestaroseHP、BestaroseDiomondMMC、UniphereS、MacroPrepS、POROSXS、SP-6FF、SP-6HP、SPSepharoseTMFastFlow；优选使用NanoGel50SP或SPBestaroseHP。阳离子交换层析可选择pH梯度洗脱或者氯化钠浓度梯度洗脱，优选氯化钠梯度洗脱。在一种实施方式中，选择pH和氯化钠梯度结合的方式洗脱，洗杂缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.13M氯化钠，0.3M氯化钠，pH为5.9，洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.1M氯化钠，0.3M氯化钠，pH为7.0。在另一种实施方式中，选择氯化钠梯度洗脱，层析过程的洗杂和洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.15M氯化钠，0.3M氯化钠，pH为7.0。步骤3)中阴离子交换层析的填料选自QBestaroseFastFlow、QBestaroseHP、BestaroseDEAE、QSepharoseTMHP、QSepharoseTMFastFlow、DEAESepharoseTMFastFlow、UniGel30/80Q、NanoGel30/50Q、UNOSphereQ。优选使用博格隆QFF或汇研QHP。阴离子交换层析可选择氯化钠浓度梯度洗脱。在一种实施方式中，层析过程的洗杂和洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.2M氯化钠，0.3M氯化钠，pH均为7.0。经阴离子交换层析获得的目标洗脱组分可用已知的方法进行浓缩、冷冻干燥法等制成成品。在阳离子交换层析中，使用的上样缓冲液包括磷酸盐缓冲液，其pH小于7.5，盐浓度小于0.12M。阳离子交换层析中目标物(重组人纤维连接蛋白)的洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液和氯化钠；pH为6.8-7.1，优选的氯化钠浓度为0.3M，缓冲液的pH为7.0。在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为SPBestaroseHP时，使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、0.09-0.13M氯化钠，pH为5.8-7.1。在另一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为NanoGel50SP时，使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、0.12-0.3M氯化钠，pH为6.8-7.1。在另一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为汇研QHP时，使用的缓冲液包括磷酸盐、0.1-0.3M氯化钠，pH为6.8-7.1。在另一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为博格隆QFF时，使用的缓冲液包括磷酸盐、0.1-0.3M氯化钠，pH为6.8-7.1。本专利技术还提供一种用于制备所述的基因工程水稻种子的植物表达载体，所述表达载体是将表达人纤维连接蛋白的基因与水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽导入质粒载体构建。优选的，所述表达人纤维连接蛋白的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述质粒载体为pOsPMP626。本专利技术所用的原料来源于表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子，利用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导Fn进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使Fn能在水稻种子内大量积累，最终达到较高的表达水平。由于水稻表达体系中不存在Fg和vWF等血浆特有的杂质，因此以水稻种子进行Fn的分离纯化具有非常大的优势，具有与其他来源不同的纯化方法。本专利技术利用阳离子和阴离子交换两步层析对表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取Fn并进行纯化，并对工艺条件进行摸索和优化，为水稻种子种分离纯化重组人纤维连接蛋白提供了一种可规模化放大的纯化工艺。附图说明图1为质粒pOsPMP626结构示意图。图2为质粒pOsPMP627结构示意图。图3为质粒pOsPMP628结构示意图。图4为T1代基因工程材料中目的基因的阳性检测，其中M为DNA标准分子量Marker；PMP628-51、628-62、628-63、628-64、628-65、628-68、628-69和628-71为T1代转基因材料；NC，阴性对照受体品种；P为阳性对照质粒。图5为T1代基因工程材料中标记基因的阳性检测，其中M为DNA标准分子量Marker；PMP628-51、628-62、628-63、6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：/n1)从重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液；/n2)将含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物；/n3)将所述初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人纤维连接蛋白目标物；/n其中阳离子交换层析的填料选自Nano Gel 30/50SP、Uni Gel 30/80SP、SP BestaroseFF、SP Bestarose HP、Bestarose Diomond MMC、Uniphere S、MacroPrep S、POROS XS、SP-6FF、SP-6HP、SP Sepharose

【技术特征摘要】
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：
1)从重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液；
2)将含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物；
3)将所述初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人纤维连接蛋白目标物；
其中阳离子交换层析的填料选自NanoGel30/50SP、UniGel30/80SP、SPBestaroseFF、SPBestaroseHP、BestaroseDiomondMMC、UniphereS、MacroPrepS、POROSXS、SP-6FF、SP-6HP、SPSepharoseTMFastFlow；阴离子交换层析的填料选自QBestaroseFastFlow、QBestaroseHP、BestaroseDEAE、QSepharoseTMHP、QSepharoseTMFastFlow、DEAESepharoseTMFastFlow、UniGel30/80Q、NanoGel30/50Q、UNOSphereQ。


2.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子交换层析的填料为NanoGel50SP。


3.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换层析的填料为QBestaroseFF。


4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)所述重组人纤维连接蛋白粗提取液是通过下述方法制备，包括步骤：
4a)以表达重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子为原料，将稻谷脱壳抛光成半精米并研磨成80-100目的米粉；
4b)将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得蛋白粗提取物；所述提取缓冲液为：10-50mMTris、10-50mMPB，0-110mMNaCl，pH5.9-8.0；
4c)将粗蛋白提取物过滤，得到含重组人纤维连接蛋白的粗提取液。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤4b)中的提取缓冲液中添加0.8-1mMPMSF、5-10mMGSH和0.05-0.1％Tween80中的一种或数种。


6.根据权利要求1所述的方法，将由步骤1)获得的含重组人纤维连接蛋白的粗蛋白提取液经过阳离子交换层析，进行初级分离纯化，获得含重组人纤维连接蛋白的初级产物；其中：所述阳离子交换层析介质为纳微NanoGel50SP阳离子交换填料，层析步骤为：
6a)采用5-15倍柱体积的组分为10-50mMPB，0-120mMNaCl，pH为6.8-7.1的平衡缓冲液，以50-200cm/小时的流速平衡层析柱；
6b)以步骤1)的蛋白粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2.5-13.5
ms/cm，pH为6.8-7.1；

【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，占全，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42