用于神经变性疾病和神经炎性疾病的诊断和预后的方法技术

本发明专利技术涉及用于由神经学疾病、神经变性疾病和/或衰老疾病引起的脑炎症状态的早期诊断和预后的方法。所述方法基于定性‑定量评价在受试者血浆中的小神经胶质微囊泡。

Methods for diagnosis and prognosis of neurodegenerative and neuroinflammatory diseases

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于神经变性疾病和神经炎性疾病的诊断和预后的方法
本专利技术涉及用于由神经学疾病、神经变性疾病和/或衰老疾病引起的脑炎症状态的早期诊断和预后的方法。所述方法基于定性-定量评价在受试者血浆中的小神经胶质微囊泡。现有技术用于阿尔茨海默病(AD)和其他形式的与神经炎症和/或神经变性和衰老相关的痴呆和疾病(例如，帕金森病、多发性硬化、神经性疼痛)的诊断和预后的生物标志物的鉴定和验证越来越重要。迄今为止，通过ELISA测定法来定量测量在脑脊液(CSF)中的β-淀粉状蛋白(1-42)、总tau和磷酸化tau-181是最先进的和公认的用于诊断AD的发病概率的方法。在CSF中，已证明了与神经炎症和与AD相关的小神经胶质微囊泡的增加(AgostaF等人,MyeloidmicrovesiclesincerebrospinalfluidareassociatedwithmyelindamageandneuronallossinmildcognitiveimpairmentandAlzheimerdisease.AnnNeurol.201476(6):813-25)。最近已经鉴定出一种能够选择性地鉴定小神经胶质从而将其与骨髓系统中的其他细胞区分开的标志物。所述标志物为跨膜蛋白119(Tmem119)(BennettML等人,NewtoolsforstudyingmicrogliainthemouseandhumanCNS.ProcNatlAcadSciUSA2016113(12):E1738-46)。Bennett等人描述了能够识别Tmem119的细胞内结构域和细胞外结构域的单克隆抗体，其允许在脑的组织学切片中的小神经胶质的免疫染色。新的生物标志物(其测量是可重复的，和优选地在血液样品中是可能的)的鉴定仍然是主要挑战。专利技术描述本专利技术的作者令人惊讶地显示，在受神经炎性疾病、神经变性疾病和/或衰老疾病(例如，AD和额颞叶痴呆(FTD))侵袭的患者的血液样品中存在小神经胶质微囊泡，但在健康个体中不存在。因此，本专利技术涉及一种用于由神经学疾病、神经变性疾病、炎性疾病和/或衰老疾病引起的脑炎症状态的早期诊断的方法，其中所述方法包括在血浆样品中定性-定量测量小神经胶质微囊泡。所述方法包括：-对血浆样品进行分级分离以分离出微囊泡级分，其中所述分级分离通过将所述血浆样品以大约14000g离心10秒钟至40分钟(优选地，大约30分钟或20分钟)的时间来进行；-分析所述微囊泡级分以鉴定小神经胶质微囊泡；其中在所述样品中所述小神经胶质微囊泡的存在指示了神经炎性疾病、神经变性疾病和/或神经学疾病和/或衰老疾病。所述小神经胶质微囊泡的鉴定通过本领域技术人员已知的方法来进行。在一个优选的实施方案中，所述方法包括在从所述血浆样品中分离出的小神经胶质微囊泡级分中测量一种或多种特异性小神经胶质微囊泡标志物。在一个优选的实施方案中，所述至少一种标志物为Tmem119。与Tmem119相关的优点与下述事实有关：在本文中令人惊讶地观察到其在血浆中的延长的稳定性。在一个实施方案中，所述一种或多种标志物通过免疫学方法来进行测量。在一个进一步的实施方案中，所述测量通过分子分析来进行。根据本专利技术的方法令人惊讶地在神经变性疾病和神经学疾病的早期诊断中是有利的。在一个实施方案中，所述小神经胶质微囊泡的分析是定量分析，其中在血浆中所述小神经胶质微囊泡的浓度与神经炎性疾病、神经变性疾病和/或神经学疾病的严重性程度相关。附图说明图1：对于对照血液样品和来自具有AD或FTD的患者的血液样品的Tmem119分子分析。图2：对于对照血液样品和来自具有AD的患者的血液样品的Tmem119的免疫学分析。图3：在根据本专利技术的方法(A)或用比较方法(B)进行处理的样品中的miRNA1表达。图4：通过FACS的小神经胶质微囊泡分离的代表性图像。图5：TMEM119氨基酸序列。细胞外部分29-96以灰色突出显示。对于对照受试者和罹患神经炎性疾病和/或神经变性疾病的受试者的血浆样品(从其中通过本领域技术人员已知的方法分离出微囊泡)进行的分子和免疫学测定法显示，仅在受到神经炎性疾病和/或神经变性疾病侵袭的样品中，在所述血浆中存在的微囊泡群体包含小神经胶质微囊泡。令人惊讶的是，本专利技术的作者已经显示，在对照受试者的血浆中不存在小神经胶质微囊泡，其中所述对照受试者相比于所分析的病理学受试者而言是年龄均一的受试者，所有受试者的年龄都在72岁和80岁之间。在血浆中小神经胶质微囊泡还随着疾病进展而增加，这使得其测量成为用于监测所述疾病的可选方法。Tmem119作为特异性的且稳定的小神经胶质微囊泡标志物的可得性使得根据本专利技术的诊断和预后方法成为用于神经炎性疾病和/或神经变性疾病和/或神经学疾病的诊断和/或预后的可选方法。在一个优选的实施方案中，通过将血浆样品以大约14000g离心10秒钟至40分钟(优选地，20分钟或2分钟)的时间来分离所述小神经胶质微囊泡。备选地，通过FACS分选或者通过用珠粒的免疫亲和测定法或者通过排阻层析来分离所述微囊泡。实施例1：通过分子分析来鉴定在血浆样品中的Tmem119。从被分类为对照受试者、罹患AD的受试者、罹患FTD的受试者的受试者中收集500μl的血浆。受试者选自72岁至80岁的均一年龄。通过本领域技术人员已知的方法来分离所述微囊泡。具体而言，如下来分离所述微囊泡：1.在+4℃下将所述血浆以300g离心5分钟；2.将上清液转移到新的1.5ml管中；3.在+4℃下将所述上清液以14000g离心30分钟，从而沉淀出所述微囊泡；4.将所述上清液转移到新的1.5ml管中；5.从通过在步骤4中提到的离心而获得的粒状沉淀中进行总RNA提取。使用miRCURYRNA分离试剂盒(CELL&PLANT#588711,Exiqon)来提取总RNA，其中使用下述程序：将350μl的包含10μl/mlβ-巯基乙醇的裂解缓冲液添加至沉淀物，然后将其涡旋振荡10秒钟。将200μl的纯乙醇添加至所得的裂解物，并且涡旋振荡10秒钟。将所述裂解物加载到柱子上，其然后以3500g离心1分钟。去除洗脱物，并且重新装配柱子，其中重复所述离心步骤直至将所述裂解物完全洗脱。为了DNA去除，将35μl的DNA消化缓冲液和5μL的DNA酶I(ZymoResearchDNaseI#ZYE1010)相混合，并且直接添加至柱基质并在室温下温育15分钟。然后，施加400μl的洗涤溶液，并且以14000g离心1分钟。在去除洗脱物后，重新装配柱子，并且施加400μl的洗涤溶液并以14000g离心1分钟。通过以14000g离心2分钟来重复该操作，以便彻底干燥树脂。去除洗脱物，并且将柱子放置在新的1.7ml洗脱管中。然后，添加5μl的洗脱缓冲液，并且将柱子以200g离心2分钟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于神经炎性疾病、神经学疾病和/或神经变性疾病和衰老疾病的诊断和/或预后的方法，其中所述方法包括：/n-将血浆样品以大约14000g离心10秒钟至40分钟的时间段，从而沉淀出微囊泡级分。/n-分离所述微囊泡级分并对其进行分析以鉴定小神经胶质微囊泡，/n其中在所述血浆样品中小神经胶质微囊泡的存在指示了神经炎性疾病、神经变性疾病和/或神经学疾病和/或衰老疾病。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170921 IT 1020170001054831.一种用于神经炎性疾病、神经学疾病和/或神经变性疾病和衰老疾病的诊断和/或预后的方法，其中所述方法包括：
-将血浆样品以大约14000g离心10秒钟至40分钟的时间段，从而沉淀出微囊泡级分。
-分离所述微囊泡级分并对其进行分析以鉴定小神经胶质微囊泡，
其中在所述血浆样品中小神经胶质微囊泡的存在指示了神经炎性疾病、神经变性疾病和/或神经学疾病和/或衰老疾病。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析是定量类型的，并且在所述血浆中所述小神经胶质微囊泡的更高的浓度相应于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·切尔驰亚，F·比安寇，
申请(专利权)人：品牌科技股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT