载体制造技术

本发明专利技术提供了载体的试剂盒，其包含：(i)第一载体，其包含编码第一标志物组分的核酸序列；和(ii)第二载体，其包含编码第二标志物组分的核酸序列，其中，当用第一和第二载体两者转导细胞时，细胞表达第一和第二标志物组分并缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物，然而，当用单独的第一或第二载体转导细胞时，细胞分选试剂不识别单独的第一或第二标志物组分的表达。

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】载体本专利技术涉及载体的试剂盒。例如，用于转导细胞的逆转录病毒载体。具体而言，本专利技术涉及一种试剂盒，其包括包含编码第一标志物组分的核酸的第一载体和包含编码第二标志物组分的核酸的第二载体。当用两种载体转导细胞时，两种标志物组分都在细胞中表达，并且它们缔合以形成可检测的异多聚体标志物。本专利技术还涉及制造和检测用此类载体转导的细胞的方法，以及用于治疗/预防疾病的药物组合物和方法，所述方法包括施用此类细胞的组合物。专利技术背景数十年来，病毒载体已被用于转导T细胞以表达感兴趣的多肽。这些载体利用病毒中进化的专门分子机制以将其基因组有效地转移到它们感染的细胞内。但是，它们具有有限的转移能力，通常认为约为8至10千个碱基(kb)。该限制是由于包装效率与插入物大小成反比。具有更高插入能力的基于T细胞的基因疗法的其他潜在的非病毒机制是已知的，但是这些通常因转导效率低和/或产生低T细胞数量的毒性作用而受到阻碍。为了在保持高效率的同时将大的插入物大小转导至T细胞中，可以将病毒载体上编码的基因分成两个或更多个单独的载体。每个载体都用于制备病毒，然后将所有载体汇集以转导细胞。然而，该多重转导方法通常导致细胞被转导一些但不是所有所期望的载体。这导致包含不同载体整合体的非均匀细胞群体，其将不表达所有所期望的基因。需要提供用大插入物大小转导和转染T细胞的改善的方法。附图说明图1–阐明异二聚体标志物的示意图。第一标志物组分是CD79a胞外域，并且第二标志物组分是CD79b胞外域与来自CD19的跨膜结构域和截短的胞内域之间的融合物。第一和第二标志物组分经由二硫键缔合。图2–阐明另一种异二聚体标志物的示意图。第一标志物组分是Kappa恒定结构域，并且第二标志物组分是来自IgG1的CH1结构域与来自CD19的跨膜结构域和截短的胞内域之间的融合物。第一和第二标志物经由二硫键缔合。图3–阐明异三聚体标志物的示意图。第一标志物组分是Kappa恒定结构域；第二标志物组分是CD79b胞外域与来自CD19的跨膜结构域和截短的胞内域之间的融合物；并且第三标志物是CD79a胞外域与来自IgG1的CH1结构域之间的融合物。第一、第二和第三标志物组分经由两个二硫键缔合以形成异三聚体标志物。图4–由试剂盒的第一和第二载体编码的氨基酸序列。载体编码第一和第二标志物组分，所述第一和第二标志物组分缔合以形成如图2中所示的异二聚体标志物。图5–由试剂盒的第一、第二和第三载体编码的氨基酸序列。载体编码第一、第二和第三标志物组分，所述第一、第二和第三标志物组分缔合以形成如图3中所示的异三聚体标志物。图6A：阐明第一载体和第二载体的示意图，第一载体编码第一嵌合抗原受体(CAR)、2A肽切割位点和第一标志物(CAR1-2A-Mα)；并且第二载体编码第二CAR、2A肽切割位点和第二标志物(CAR2-2A-Mβ)。在每个载体上2A肽切割位点位于标志物和CAR之间。B：阐明用图6A中所示的一种或两种载体转导细胞的效果的示意图。当用单独的第一或第二载体转导细胞时，转基因得以表达(CAR1或CAR2)，但在细胞表面没有可检测的标志物表达。当用第一和第二载体两者转导细胞时，两种CAR都得以表达，并且第一和第二标志物组分的缔合形成稳定的异二聚体标志物，其也在细胞表面表达。图7A：第一载体、第二载体和第三载体的示意图。第一载体编码第一CAR、2A肽切割位点和第一标志物(CAR1-2A-Mα)；第二载体编码第二CAR、2A肽切割位点和第二标志物(CAR2-2A-Mβ)；并且第三载体编码第三CAR、2A肽切割位点和第三标志物(CAR3-2A-Mγ)。在每个载体上2A肽切割位点位于标志物和CAR之间。B：阐明用图7中所示的一种、两种或所有三种载体转导细胞的作用的示意图。当用一种或两种载体转导细胞时，相关的转基因(即CAR)得以表达，但在细胞表面没有可检测的标志物表达。必须转导所有三种载体用于标志物表达。在转导第一、第二和第三载体时，所有三种CAR均得以表达，并且第一、第二和第三标志物组分的缔合形成了稳定的异三聚体标志物，其在细胞表面表达。图8–野生型和突变的信号序列，其适用于改变试剂盒中标志物组分的相对表达。一个载体可以编码野生型信号肽序列，而另一个载体可以编码显示为“突变1”至“突变7”的改变的序列之一。改变的序列是效率较低的信号肽，因此由具有改变的信号肽的载体编码的标志物组分在细胞中的表达水平将低于由具有野生型信号肽的载体编码的标志物组分。与标志物在相同构建体上的其他转基因的相对表达将受到类似的影响，因此由具有改变的信号肽的载体编码的感兴趣的多肽在细胞中的表达水平将低于由具有野生型信号肽的载体编码的感兴趣的多肽。图9(A.和B.)–异二聚体标志物在293T细胞(A.)和原代人T细胞(B.)中的表面表达以及异三聚体标志物在293T细胞(C.)中的表面表达。A和B：将293T细胞用异二聚体标志物的每条链(载体1和载体2)进行单转染，或用两者(载体1+载体2)进行双转染。通过用抗人Kappa链抗体、抗人Fab抗体和使用可溶性CD19染色的流式细胞术评估异二聚体标志物在双转染细胞中的成功组装。编码异二聚体标志物的两条链的质粒用作阳性对照。293KT细胞和原代人T细胞转导两者结果(使用4个健康供体样品)均表明，异二聚体标志物的选择性表达仅在双转导的T细胞中发生，而在单转导的T细胞中检测到最小的背景。C：将293T细胞用异三聚体标志物的每条链(载体1、载体2和载体3)进行单转染，或用载体1和载体2(载体1+载体2)进行双转染，或用异三聚体标志物的所有三条链(载体1+载体2+载体3)进行三转染。使用流式细胞术通过对可溶性CD19染色来评估异三聚体标志物的成功组装。结果表明，当用一种或两种载体转导细胞时，在细胞表面没有可检测的标志物表达。必须转导所有三种载体用于标志物表达。专利技术概述专利技术人已经开发了包含核酸序列的载体的试剂盒，每个核酸序列编码标志物组分。标志物组分在缔合后稳定并形成可检测的异多聚体标志物。因此，在第一方面，本专利技术提供了载体的试剂盒，其包含：(i)第一载体，其包含编码第一标志物组分的核酸序列；和(ii)第二载体，其包含编码第二标志物组分的核酸序列。当用第一和第二载体两者转导细胞时，细胞表达第一和第二标志物组分并缔合形成可用试剂如细胞分选试剂识别的异多聚体标志物。当用单独的第一或第二载体转导细胞时，细胞分选试剂不识别单独的第一或第二标志物组分的表达。第一标志物组分在不与第二标志物组分缔合时可以是不稳定的。在这种排列中，试剂或细胞分选试剂可以识别第一标志物组分。或者，第一和第二标志物组分两者在未缔合时可以是不稳定的。在这种排列中，试剂或细胞分选试剂可以识别第一或第二标志物组分。第一标志物组分可以是膜结合的，并且在不存在第一标志物组分的情况下，第二标志物组分可以被分泌。在这种排列中，试剂或细胞分选试剂可以识别第二标志物组分。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.载体的试剂盒，其包含：/n(i)第一载体，其包含编码第一标志物组分的核酸序列；和/n(ii)第二载体，其包含编码第二标志物组分的核酸序列，/n其中，当用所述第一和第二载体两者转导细胞时，所述细胞表达所述第一和第二标志物组分并且它们缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物，/n而当用单独的所述第一或第二载体转导细胞时，所述细胞分选试剂不识别单独的所述第一或第二标志物组分的表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171101 GB 1718088.61.载体的试剂盒，其包含：
(i)第一载体，其包含编码第一标志物组分的核酸序列；和
(ii)第二载体，其包含编码第二标志物组分的核酸序列，
其中，当用所述第一和第二载体两者转导细胞时，所述细胞表达所述第一和第二标志物组分并且它们缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物，
而当用单独的所述第一或第二载体转导细胞时，所述细胞分选试剂不识别单独的所述第一或第二标志物组分的表达。


2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述第一标志物组分在不与所述第二标志物组分缔合时是不稳定的，并且所述细胞分选试剂识别所述第一标志物组分。


3.根据权利要求1或2的试剂盒，其中所述第一和第二标志物组分两者在未缔合时都是不稳定的，并且所述细胞分选试剂识别所述第一或第二标志物组分。


4.根据权利要求1至3中任一项的试剂盒，其中所述第一标志物组分是膜结合的，并且在不存在所述第一标志物组分的情况下，所述第二标志物组分被分泌，且所述细胞分选试剂识别所述第二标志物组分。


5.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，其中一个标志物组分包含Kappa恒定结构域，而另一个标志物组分包含来自IgG1的CH1结构域。


6.根据权利要求1至4中任一项的试剂盒，其中一个标志物组分包含CD79a胞外域，而另一个标志物组分包含CD79b胞外域。


7.根据权利要求1的试剂盒，其包含第三载体，所述第三载体包含编码第三标志物组分的核酸序列，
其中，当用所述第一、第二和第三载体转导细胞时，所述细胞表达所述第一、第二和第三标志物组分并且它们缔合形成由细胞分选试剂识别的异多聚体标志物；
而当用所述第一、第二或第三载体中的一个或两个转导细胞时，所述细胞分选试剂不识别所述第一、第二或第三标志物组分中的一个或两个的表达。


8.根据权利要求7的试剂盒，其中所述第一、第二和/或第三标志物组分在不作为所述异多聚体标志物缔合时是不稳定的。


9.根据权利要求8的试剂盒，其中所述第一标志物组分是膜结合的；在不存在所述第一标志物组分的情况下，所述第二标志物组分被分泌；除非还表达了所述第一和第二标志物组分，否则所述第三标志物组分被分泌；并且其中所述细胞分选试剂识别所述第三标志物组分。


10.根据权利要求9的试剂盒，其中所述第一标志物组分包含膜结合的CD79a胞外域，并且所述第二标志物包含来自IgG1的CH1结构域和CD79a胞外域，并且所述第三标志物包含Kappa恒定结构域。


11.根据前述权利要求中任一项的载体的试剂盒，其中所述载体中的至少一个进一步包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。


12.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，其中一种标志物组分在所述细胞中的表达水平不同于另一种标志物组分在所述细胞中的表达水平。


13.根据权利要求12的试剂盒，其中编码所述两种标志物组分的载体包含不同的信号序列。


14.细胞表面异多聚体标志物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：S托马斯，S奥诺哈，S科多巴，
申请(专利权)人：奥托路斯有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB