具有改变的PAM特异性的工程化的CRISPR-Cas9核酸酶制造技术

具有改变的和改进的PAM特异性的工程化的CRISPR‑Cas9核酸酶及其在基因组工程、表观基因组工程、和基因组靶向中的应用。

Engineered crispr-cas9 nuclease with altered PAM specificity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改变的PAM特异性的工程化的CRISPR-Cas9核酸酶优先权声明本申请要求2017年8月23日提交的美国临时专利申请系列号No.62/549,303的权益；以及2018年3月12日提交的美国临时专利申请系列号No.62/641,687的权益。上述的全部内容通过引用并入本文。联邦政府赞助的研究或开发本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的资助号No.GM105378、GM107427、GM118158和GM088040的政府资助下完成的。政府在本专利技术中享有一定的权利。
本专利技术至少部分涉及工程化的成簇规律间隔的短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)核酸酶，其具有改变和改进的前间区序列邻近基序(ProtospacerAdjacentMotif,PAM)特异性及其在基因组工程、表观基因组工程和基因组靶向中的用途。
技术介绍
CRISPR-Cas9核酸酶能够在多种生物体和细胞类型中实现有效的、可定制的基因组编辑(Sander&Joung,NatBiotechnol32,347-355(2014)；Hsuet等人,Cell157,1262-1278(2014)；Doudna&Charpentier,Science346,1258096(2014)；Barrangou&May,ExpertOpinBiolTher15,311-314(2015))。Cas9的靶位点识别由两个称为crRNA和tracrRNA的短RNA指导(Deltcheva等人,Nature471,602-607(2011)；Jinek等人,Science337,816-821(2012))，可以将其融合至嵌合单指导RNA(sgRNA)中(Jinek等人,Science337,816-821(2012)；Jinek等人,Elife2,e00471(2013)；Mali等人,Science339,823-826(2013)；Cong等人,Science339,819-823(2013))。sgRNA的5'端(源自crRNA)可以与靶DNA位点碱基配对，从而可以通过Cas9/sgRNA复合物直接对位点特异性切割进行重新编程(Jinek等人,Science337,816-821(2012))。但是，Cas9还必须识别与sgRNA碱基配对的DNA邻近的特定前间区序列邻近基序(PAM)(Mojica等人,Microbiology155,733-740(2009)；Shah等人,RNABiol10,891-899(2013)；Jinek等人,Science337,816-821(2012)；Sapranauskas等人,NucleicAcidsRes39,9275-9282(2011)；Horvath等人,JBacteriol190,1401-1412(2008))，这是启动序列特异性识别所必需的要求(Sternberg等人,Nature507,62-67(2014))，但也可以限制用于基因组编辑的这些核酸酶的靶向范围。广泛使用的化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)识别短的NGGPAM(Jinek等人,Science337,816-821(2012)；Jiang等人,NatBiotechnol31,233-239(2013))，在随机DNA序列中每8bp发生一次。相比之下，迄今已表征的其他Cas9直系同源物可以识别更长的PAM(Horvath等人,JBacteriol190,1401-1412(2008)；Fonfara等人,NucleicAcidsRes42,2577-2590(2014)；Esvelt等人,NatMethods10,1116-1121(2013)；Ran等人,Nature520,186-191(2015)；Zhang等人,MolCell50,488-503(2013))。例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cas9(SaCas9)是几种更适合病毒递送的较小Cas9直系同源物之一(Horvath等人,JBacteriol190,1401-1412(2008)；Ran等人,Nature520,186-191(2015)；Zhang等人,MolCell50,488-503(2013))，识别更长的NNGRRTPAM，预期在随机DNA中每32bp发生一次。扩大Cas9直系同源物的靶向范围对于包括修饰小遗传元件(例如转录因子结合位点(Canver等人Nature.527(7577):192-7(2015)；Vierstra等人,NatMethods.12(10):927-30(2015))或通过在PAM中定位序列差异进行等位基因特异性改变(Courtney,D.G.等人GeneTher.23(1):108-12(2015))等各种应用是重要的。我们先前工程化了可以识别具有NGA和NGCGPAM序列的位点的SpCas9变体(Kleinstiver等人,Nature2015；WO2016141224)，但是许多替代的PAM序列仍然是不可靶向的。
技术实现思路
如本文所述，常用的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)通过使用结构信息、基于细菌选择的定向进化和组合设计进行工程化以识别新的PAM序列。这些改变后的PAM特异性变体能够对野生型SpCas9无法有效靶向的人类细胞中的报道基因位点和内源性基因位点进行强有力的编辑。本发现提供广泛有用的SpCas9变体，在本文中统称为“变体”或“所述变体”。在第一方面，本专利技术提供分离的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下三个、四个、五个或全部六个位置具有突变：D1135、S1136、G1218、E1219、R1335和/或T1337，例如，在D1135、S1136、G1218、E1219、R1335和/或T1337(D1135X/S1136X/G1218X/E1219X/R1335X/T1337X，其中X为任意氨基酸)中的二个、三个、四个、五个或全部的位置具有突变，例如，包含具有所示突变的与SEQIDNO：1的氨基酸序列至少80％、90％或95％相同的序列。在一些实施方案中，所述变体SpCas9蛋白包含表A、1、2或3中所示的突变的组，例如以下突变的组之一：LRSVQL、LRKIQK、LRSVQK、LWKIQK、VRKIQK、LWKIQK、IRAVQL、VRKLRS、GRKIQK、SWRVVV、SWKVLK、TAHFKV、MSGVKC、LRSVRS、SKTLRP、MWVHLN、TWSMRG、KRRCKV、VRAVQL、VSSVRS、VRSVRS、SRMHCK、GWKLLR、GWKOQK、VAKLLR、VAKIQK、VAKILR、GRKILR、VRKLLR、IRAVQL、VRKIQK或VRMHCK变体(例如，对于NGTNPAM)；MQKSER、VRKSER、ICKSER、LRS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下三个、四个、五个或全部六个位置具有突变：D1135、S1136、G1218、E1219、R1335和/或T1337，其中所述突变不是VSREER或VSREQR。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170823 US 62/549,303;20180312 US 62/641,6871.一种分离的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下三个、四个、五个或全部六个位置具有突变：D1135、S1136、G1218、E1219、R1335和/或T1337，其中所述突变不是VSREER或VSREQR。


2.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其包含与SEQIDNO：1的氨基酸序列至少80％相同的序列。


3.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其包含表A、1、2或3中所示的突变的组。


4.根据权利要求1-3任一项所述的分离的蛋白，其包含以下突变的组：LRSVQL、LRKIQK、LRSVQK、LWKIQK、VRKIQK、LWKIQK、IRAVQL、VRKLRS、GRKIQK、SWRVVV、SWKVLK、TAHFKV、MSGVKC、LRSVRS、SKTLRP、MWVHLN、TWSMRG、KRRCKV、VRAVQL、VSSVRS、VRSVRS、SRMHCK、GWKLLR、GWKOQK、VAKLLR、VAKIQK、VAKILR、GRKILR、VRKLLR、IRAVQL、VRKIQK或VRMHCK变体(例如，对于NGTNPAM)；MQKSER、VRKSER、ICKSER、LRSVER、LWLETR、LSRWER、MQSVQL、VRREER、ICCCER、LSRWQR、LWRVVA、WMQAYG、LWRSEY、SQSWRS、LKAWRS、LWGWQH、MCSFER、LWMREQ、LWRVVA、HSSWVR、MWSEPT、GSNYQS、FMQWVN、YCSWVG、MCAWCG、FMQWVR或SSKWPA变体(例如，对于NGCNPAM)；LRSVRS、SRQMRG、MRARKE、SRMHCK、VRREQR、VRGEQR、LRLSAR、AWTEVTR、KWMMCG、VRGAKE、AWNFQV、LWTTLN、SRMHCK、CWCQCV、AEEQQR、GWEKVR、NRAVNG、LRSYLH、VRGNNR、VQDAQR、GWRQSK、AWLCLS、KWARVV、MWAARP、SRMHCK、VKMAKG、QRKTRE、LCRQQR、CWSHQR、SRTHTQ、LWEVIR、VSSVRS、VRSVRS、IRAVRS、SRSVRS、LWKIQK或VRMHCK变体(例如，对于NGANPAM)。


5.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其进一步包含一种或多种降低核酸酶活性的突变，所述突变选自由在D10、E762、D839、H983、或D986处；和在H840或N863处的突变组成的组。


6.根据权利要求5所述的分离的蛋白，其中所述突变是：
(i)D10A或D10N，和
(ii)H840A、H840N或H840Y。


7.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其进一步包含一种或多种增加特异性的突变，所述突变选自由在N497、R661、N692、M694、Q695、H698、K810、K848、Q926、K1003和R0160处，和任选地在K526和/或R691处的突变组成的组。


8.根据权利要求7所述的分离的蛋白，其包含突变N692A、Q695A、Q926A、H698A、N497A、R661A、M694A、K810A、K848A、K1003A、R0160A、Y450A/Q695A、L169A/Q695A、Q695A/Q926A、Q695A/D1135E、Q926A/D1135E、Y450A/D1135E、L169A/Y450A/Q695A、L169A/Q695A/Q926A、Y450A/Q695A/Q926A、R661A/Q695A/Q926A、N497A/Q695A/Q926A、Y450A/Q695A/D1135E、Y450A/Q926A/D1135E、Q695A/Q926A/D1135E、L169A/Y450A/Q695A/Q926A、L169A/R661A/Q695A/Q926A、Y450A/R661A/Q695A/Q926A、N497A/Q695A/Q926A/D1135E、R661A/Q695A/Q926A/D1135E和Y450A/Q695A/Q926A/D1135E；N692A/M694A/Q695A/H698A、N692A/M694A/Q695A/H698A/Q926A；N692A/M694A/Q695A/Q926A；N692A/M694A/H698A/Q926A；N692A/Q695A/H698A/Q926A；M694A/Q695A/H698A/Q926A；N692A/Q695A/H698A；N692A/M694A/Q695A；N692A/H698A/Q926A；N692A/M694A/Q926A；N692A/M694A/H698A；M694A/Q695A/H698A；M694A/Q695A/Q926A；Q695A/H698A/Q926A；G582A/V583A/E584A/D585A/N588A/Q926A；G582A/V583A/E584A/D585A/N588A；T657A/G658A/W659A/R661A/Q926A；T657A/G658A/W659A/R661A；F491A/M495A/T496A/N497A/Q926A；F...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·K·乔昂格，B·克莱因斯蒂弗，
申请(专利权)人：通用医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US