一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法技术

本发明专利技术涉及生物科技技术领域，具体的说是一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法，包括心肌肌钙蛋白I溶液配制、微流控肌钙蛋白检测芯片及其使用方法、微流控芯片是以微管道网络为结构特征，各工作单元既能独立完成单一反应或单元操作，也能与其他单元合作完成较复杂的工作，使整个芯片称为一个动态的反应体系。其主要特点是高通量、微型化和自动化，是在传统生物技术和疾病诊断等方面的创新和飞跃；免疫微球化学发光与微流控芯片的结合使得全自动化仪器更加小型化和简单化，减少了后期的管道维护和机械臂维护；而且这两者的结合又将原本POCT应用的固相反应转换成了液相的均相反应，更兼具了传统管式化学发光的高反应效率，高灵敏度及检测区间。

A quantitative detection method of cardiac troponin I

【技术实现步骤摘要】
一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法
本专利技术涉及生物科技
，具体的说是一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法。
技术介绍
心脏横纹肌收缩中起主要调节作用的蛋白质。有三个亚基：与原肌球蛋白结合的肌钙蛋白T、调节肌动蛋白ATP酶活性的肌钙蛋白I和钙结合的肌钙蛋白C。cTnI和cTnT的临床应用价值相同，不需要同时检测。心肌肌钙蛋白I是具有抑制性的亚基,分子量为24000Da，等电点在9以上。其存在三种形式，分别是心肌肌钙蛋白I、快型骨骼肌肌钙蛋白I和慢型骨骼肌肌钙蛋白I。其中前者特异的存在于心肌中，分子量为24000Da，后两者存在于骨骼肌中，分子量为19800Da。三者由不同亚基进行编码，其中心肌肌钙蛋白I的氨基酸序列仅有50％左右与两种骨骼肌肌钙蛋白I同源，并且与骨骼肌肌钙蛋白I相比，心肌肌钙蛋白I有额外的31个氨基酸残基。且骨骼肌、肝、肾等细胞破坏均不影响其结果的判断，因此肌钙蛋白I具有良好的特异性。当心肌细胞发生损伤时，肌原纤维发生裂解使得肌钙蛋白I通过外周释放入血液当中最后通过肾脏代谢。由于肌钙蛋白I具有高度的组织特异性，在血液中6小时达到峰值、持续时间长达72小时并且灵敏度高，从而使得微量的肌钙蛋白I的存在即可诊断心肌损伤，因此目前已经被美国临床生化研究院推荐为诊断急性心肌梗死的金标准。cTnI除了诊断心肌损伤和AMI以外，在心血管疾病方面还有着其他的广泛应用，如对疑似AMI病人进行风险评估；手术及预后的病情评估、对其峰值的检测可以对梗死面积进行评估同时还可以反应心肌细胞的坏死数量、心肌炎检测、心肌挫伤和外伤受伤程度的评估、药物造成的心肌毒性评估等，此外脓毒血症导致的心衰以及甲状腺诱发的心肌受损也可以通过cTnI进行诊断。关于cTnI的检测方法，最准确的方法是LC-MS法，此法是最准确的cTnI测定方法，但是由于仪器操作困难繁琐且周期长，仍然停留在实验室科研项目中使用。目前应用最多的是基于免疫分析方法对cTnI进行定量检测。其中最早出现的放射性免疫分析法(RIA)定量检测cTnI，该方法虽然灵敏度较高，但是由于其操作复杂、出结果时间慢并且对操作人员和环境都带来了严重的危害，因此目前已经被淘汰。在放免分析后出现的cTnI免疫分析试剂是酶联免疫试剂(ELISA)，该方法虽然操作简单反应时间快，但是灵敏度和特异性都很差，因此不能适用于心肌损伤和早期AMI的诊断，目前已经应用不多。基于化学发光免疫分析法(CLIA)的cTnI检测试剂是目前应用最广泛的也是性能最好的cTnI试剂，其不但灵敏度高而且特异性强，根据其最低检出限还可以分为超敏肌钙蛋白I试剂盒和普通肌钙蛋白I试剂，前者由于灵敏度极好(目前部分超敏肌钙蛋白I试剂的灵敏度已经可以达到pg级别)对于心肌损伤和早期AMI的诊断具有重要的意义。除上述三种大型cTnI免疫分析试剂外，还有一种cTnI试剂目前也被广泛使用，即胶体金法，由于其便携、简单并且出结果速度快也被称为POCT(Pointofcaretest)诊断，但是受限于灵敏度和半定量的特点目前只能应用于晚期AMI初筛和AMI急诊。以外还有荧光免疫cTnI试剂盒和免疫比浊法cTnI试剂，但是由于其灵敏度和特异性问题，目前使用不多。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法，包括以下步骤：(1)心肌肌钙蛋白I溶液配制：1A、心肌肌钙蛋白I系列校准品的制备：用小牛血清将心肌肌钙蛋白I抗原梯度稀释成一组校准品，浓度范围为0～100ng/mL；1B、心肌肌钙蛋白I抗体包被的磁珠溶液的制备：方案A：a1、将1.5μL羧基磁微粒用活化/偶联缓冲液充分清洗3次，在最后一轮洗涤后，将微球重悬于活化/偶联缓冲液中，并确保磁微粒保持分散态；a2、在室温条件下用去离子水配制200mMEDC和200mMSulfo-NHS活化试剂；a3、向每mg洗涤后的磁微粒中快速加入24μL200mMEDC和240μL200mMSulfo-NHS；a4、室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30分钟后磁吸后去除上清，然后加入活化/偶联缓冲液洗涤微球并充分洗涤3次；a5、重悬磁微粒后按每mg磁珠加入20～80μg，充分混匀后在室温下用转盘式混合器混合悬液2.5小时，磁吸后去除上清，加入1mL含0.5％牛血清白蛋白的Tris溶液，室温下用转盘式混合器反应0.5小时；a6、磁吸去上清，用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤3次，并以此最终保存于2～8℃；方案B：b1、用PBS缓冲液制备Biotin溶液，将每mg抗体与25μLBiotin溶液室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；b2、用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液将1.5μm链霉亲和素磁微粒洗涤三次，在每mg磁微粒中加入20～80μg已处理的抗体，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育0.5～2小时；b3、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤三次后加入保存液2～8℃保存。1C、碱性磷酸酶标记的心肌肌钙蛋白I抗体溶液的制备：c1、用PBS缓冲液配制SPDP溶液，在每mg抗体中加入20～50μLSPDP溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；c2、用PBS缓冲液配制2-IT溶液，在每mg碱性磷酸酶中加入20～50μL2-IT溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；c3、经处理后的抗体和碱性磷酸酶等比例混合，室温涡旋震荡后继续用转盘式混合器孵育2小时，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；c4、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液进行稀释并于2～8℃保存；1D、化学发光底物液的制备：AMPPD加入到高PH值的Tris盐酸缓冲液中，加入无机盐和表面活性剂；1E、清洗液的制备：在Tris盐酸缓冲体系中加入20％氯化钠，2％吐温以及0.2％曲拉通；(2)微流控肌钙蛋白检测芯片及其使用方法：2A、标准曲线的制作：取10μL心肌肌钙蛋白I梯度校准品，浓度为0，0.05，0.2，1，5，25，100ng/mL，加入到微流控芯片校准品槽中，取50μL试剂加入到对应的试剂槽中，根据配套仪器内部设置的反应过程进行反应，读取光子信息后将由仪器处理并直接获得标准曲线；2B、微流控肌钙蛋白检测芯片操作流程：b1、注入50微升的全血，全血为男性样本，血溶比为53％，即血浆占比47％、血球占比53％，至全血储存槽(1)，注入15微升带有捕捉抗体的免疫微球至第一试剂储存槽(7)，注入15微升的酶标(带有侦测抗体)至第二试剂储存槽(10)；b2、以5000RPM，加速度为10000RPM/s操控盘式芯片进行旋转60秒钟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)心肌肌钙蛋白I溶液配制：/n1A、心肌肌钙蛋白I系列校准品的制备：用小牛血清将心肌肌钙蛋白I抗原梯度稀释成一组校准品，浓度范围为0～100ng/mL；/n1B、心肌肌钙蛋白I抗体包被的磁珠溶液的制备：/n方案A：/na1、将1.5μL羧基磁微粒用活化/偶联缓冲液充分清洗3次，在最后一轮洗涤后，将微球重悬于活化/偶联缓冲液中，并确保磁微粒保持分散态；/na2、在室温条件下用去离子水配制200mM EDC和200mM Sulfo-NHS活化试剂；/na3、向每mg洗涤后的磁微粒中快速加入24μL 200mM EDC和240μL 200mM Sulfo-NHS；/na4、室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30分钟后磁吸后去除上清，然后加入活化/偶联缓冲液洗涤微球并充分洗涤3次；/na5、重悬磁微粒后按每mg磁珠加入20～80μg，充分混匀后在室温下用转盘式混合器混合悬液2.5小时，磁吸后去除上清，加入1mL含0.5％牛血清白蛋白的Tris溶液，室温下用转盘式混合器反应0.5小时；/na6、磁吸去上清，用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤3次，并以此最终保存于2～8℃；/n方案B：/nb1、用PBS缓冲液制备Biotin溶液，将每mg抗体与25μL Biotin溶液室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；/nb2、用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液将1.5μm链霉亲和素磁微粒洗涤三次，在每mg磁微粒中加入20～80μg已处理的抗体，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育0.5～2小时；/nb3、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤三次后加入保存液2～8℃保存。/n1C、碱性磷酸酶标记的心肌肌钙蛋白I抗体溶液的制备：/nc1、用PBS缓冲液配制SPDP溶液，在每mg抗体中加入20～50μL SPDP溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；/nc2、用PBS缓冲液配制2-IT溶液，在每mg碱性磷酸酶中加入20～50μL 2-IT溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；/nc3、经处理后的抗体和碱性磷酸酶等比例混合，室温涡旋震荡后继续用转盘式混合器孵育2小时，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；/nc4、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液进行稀释并于2～8℃保存；/n1D、化学发光底物液的制备：AMPPD加入到高PH值的Tris盐酸缓冲液中，加入无机盐和表面活性剂；/n1E、清洗液的制备：在Tris盐酸缓冲体系中加入20％氯化钠，2％吐温以及0.2％曲拉通；/n(2)微流控肌钙蛋白检测芯片及其使用方法：/n2A、标准曲线的制作：取10μL心肌肌钙蛋白I梯度校准品，浓度为0，0.05，0.2，1，5，25，100ng/mL，加入到微流控芯片校准品槽中，取50μL试剂加入到对应的试剂槽中，根据配套仪器内部设置的反应过程进行反应，读取光子信息后将由仪器处理并直接获得标准曲线；/n2B、微流控肌钙蛋白检测芯片操作流程：/nb1、注入50微升的全血，全血为男性样本，血溶比为53％，即血浆占比47％、血球占比53％，至全血储存槽(1)，注入15微升带有捕捉抗体的免疫微球至第一试剂储存槽(7)，注入15微升的酶标至第二试剂储存槽(10)；/nb2、以5000RPM，加速度为10000RPM/s操控盘式芯片进行旋转60秒钟，已分离的血浆会被保留于血浆/血清储存槽(2)、血球则被保留于血球储存槽(6)，免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有侦测抗体，因离心力驱动被传送至混合培育反应槽(16)，并由微流阀门(18)而被保留于混合培育反应槽(16)；/nb3、以500RPM，加速度为800RPM/s操控盘式芯片进行旋转10秒钟，由释放气体储存槽(3)内气体来推动血浆，15微升的血浆可透过血浆/血清传送通道(4)被传送至混合培育反应槽(16)；免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有侦测抗体可由微流阀门(18)而被保留于混合培育反应槽(16)；/nb4、以1500RPM，加速度为2000RPM/s操控盘式芯片进行顺时针旋转2秒钟后急煞，再以1500RPM，加速度为2000RPM/s操控盘式芯片进行逆时针旋转2秒钟后急煞，由急煞的过程，可扰动混合培育反应槽(16)内液体以达到混合/培育的效果，免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有侦测抗体、血浆可藉由微流阀门(18)而被保留于混合培育反应槽(16)；/nb5、以220RPM，加速度为1600RPM/s操控盘式芯片进行旋转15秒钟，已完成反应的液体，酶标和血浆会突破微流阀...

【技术特征摘要】
1.一种心肌肌钙蛋白I的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)心肌肌钙蛋白I溶液配制：
1A、心肌肌钙蛋白I系列校准品的制备：用小牛血清将心肌肌钙蛋白I抗原梯度稀释成一组校准品，浓度范围为0～100ng/mL；
1B、心肌肌钙蛋白I抗体包被的磁珠溶液的制备：
方案A：
a1、将1.5μL羧基磁微粒用活化/偶联缓冲液充分清洗3次，在最后一轮洗涤后，将微球重悬于活化/偶联缓冲液中，并确保磁微粒保持分散态；
a2、在室温条件下用去离子水配制200mMEDC和200mMSulfo-NHS活化试剂；
a3、向每mg洗涤后的磁微粒中快速加入24μL200mMEDC和240μL200mMSulfo-NHS；
a4、室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30分钟后磁吸后去除上清，然后加入活化/偶联缓冲液洗涤微球并充分洗涤3次；
a5、重悬磁微粒后按每mg磁珠加入20～80μg，充分混匀后在室温下用转盘式混合器混合悬液2.5小时，磁吸后去除上清，加入1mL含0.5％牛血清白蛋白的Tris溶液，室温下用转盘式混合器反应0.5小时；
a6、磁吸去上清，用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤3次，并以此最终保存于2～8℃；
方案B：
b1、用PBS缓冲液制备Biotin溶液，将每mg抗体与25μLBiotin溶液室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
b2、用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液将1.5μm链霉亲和素磁微粒洗涤三次，在每mg磁微粒中加入20～80μg已处理的抗体，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育0.5～2小时；
b3、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤三次后加入保存液2～8℃保存。
1C、碱性磷酸酶标记的心肌肌钙蛋白I抗体溶液的制备：
c1、用PBS缓冲液配制SPDP溶液，在每mg抗体中加入20～50μLSPDP溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
c2、用PBS缓冲液配制2-IT溶液，在每mg碱性磷酸酶中加入20～50μL2-IT溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
c3、经处理后的抗体和碱性磷酸酶等比例混合，室温涡旋震荡后继续用转盘式混合器孵育2小时，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；
c4、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液进行稀释并于2～8℃保存；
1D、化学发光底物液的制备：AMPPD加入到高PH值的Tris盐酸缓冲液中，加入无机盐和表面活性剂；
1E、清洗液的制备：在Tris盐酸缓冲体系中加入20％氯化钠，2％吐温以及0.2％曲拉通；
(2)微流控肌钙蛋白检测芯片及其使用方法：
2A、标准曲线的制作：取10μL心肌肌钙蛋白I梯度校准品，浓度为0，0.05，0.2，1，5，25，100ng/mL，加入到微流控芯片校准品槽中，取50μL试剂加入到对应的试剂槽中，根据配套仪器内部设置的反应过程进行反应，读取光子信息后将由仪器处理并直接获得标准曲线；
2B、微流控肌钙蛋白检测芯片操作流程：
b1、注入50微升的全血，全血为男性样本，血溶比为53％，即血浆占比47％、血球占比53％，至全血储存槽(1)，注入15微升带有捕捉抗体的免疫微球至第一试剂储存槽(7)，注入15微升的酶标至第二试剂储存槽(10)；
b2、以5000RPM，加速度为10000RPM/s操控盘式芯片进行旋转60秒钟，已分离的血浆会被保留于血浆/血清储存槽(2)、血球则被保留于血球储存槽(6)，免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有...

【专利技术属性】
技术研发人员：林佳慧，杨意枫，倪燕婕，连海燕，钱靖，陆斐斐，
申请(专利权)人：苏州国科均豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32