流感病毒荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒荧光定量PCR检测方法，其将免疫磁珠和DEAE磁珠混合得到病毒核酸提取磁珠；使用所得的病毒核酸提取磁珠提取待检样本中的病毒核酸；采用Taqman探针与荧光定量PCR技术相结合的高分辨溶解曲线法对提取得到的病毒核酸进行荧光定量PCR扩增，从而实现待检样本中流感病毒的分型检测。本发明专利技术可用于临床快速鉴别诊断、爆发疫情时的预防控制、病毒的流行病学监测等，克服组织样本提取RNA步骤繁多，导致样本病毒RNA，影响检测灵敏度的缺陷。

Detection of influenza virus by fluorescence quantitative PCR

【技术实现步骤摘要】
流感病毒荧光定量PCR检测方法
本专利技术涉及流感病毒定量PCR检测领域，更具体的说，本专利技术涉及一种直接检测甲乙型流感病毒的流感病毒荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种常见的、传染性强、传播速度快的急性呼吸道传染病；以冬春季多见，其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。临床以高热、乏力、头痛、全身酸痛等全身中毒症状为特征。流感病毒属于正粘病毒科，为有囊膜的负链RNA病毒，其病毒基因组包括8个节段，为单链、负链RNA，编码至少10种以上蛋白。流感病毒包括甲(A)、乙(B)、丙(C)三种类型，其中甲型最容易发生变异，可感染人和多种动物，为人类流感的主要病原，常引起大流行和中小流行。乙型流感病毒变异较少，可感染人类，引起爆发或小流行。丙型较稳定，可感染人类，多为散发病例。其中，A型流感病毒又可以分为HA亚型和NA亚型。而引起感染的流感病毒的主要是A型中的H1(N1)、H3(N2)亚型和B型流感病毒。流感病毒变异性强，宿主广泛，易发生跨种间传播，给防治工作带来较大困难，常引起流感的流行，因此流感的快速诊断，对疾病的预防和早期治疗具有重大意义。流行性感冒的诊断，主要依靠病原学、特异核酸检查和血清抗体测定。传统方法，采用分离培养(如鸡胚培养)后通过血凝实验、血凝抑制实验等等进行类别确认，整体操作周期产长、特异性差。随着分子生物学的发展，多种新的诊断手段被用于各种流感病毒的诊断，如实时荧光定量PCR、恒温扩增以及基因芯片技术等。实时荧光定量PCR技术，利用PCR对核酸的高效扩增，探针技术的高特异性的特点，实现了PCR从定性到定量的飞跃，不仅克服了常规PCR检测易污染与假阳性率高的缺点，而且具有特异性强、灵敏度高和自动化操作等优点。实时荧光定量PCR最常用的两种荧光探针是SYBRGreenⅠ和Taqman探针。SYBRGreenⅠ是一种荧光染料型探针，它是在实时荧光PCR反应的过程中，插入DNA双链，发出荧光信号，实现对整个反应过程的实时监测，其荧光信号的强度与DNA模板的增加量呈正相关。Taqman探针是在实时荧光PCR的反应过程中，除了原有的一对特异性引物外，还增加一条两端分别标记荧光报告基团与荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针，PCR扩增时利用TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针水解成单核苷酸，游离的荧光报告基团导致荧光信号的增加，通过对荧光信号强度的实时动态检测对扩增产物进行定量分析。流感病毒检测中，首先需要采用RNA试剂盒从待测的组织标样(如咽拭子)提取RNA，由于RNA提取的步骤繁多，且RNA本身不稳定易于降解，不利于准确分析。高分辨探针熔解曲线法是一种新型的分析技术，是从高分辨溶解曲线技术(HRM)的基础上进行了改良，将HRM中的饱和染料用探针来替代，使检测结果更直接，更加特异，并且最大的优势是可以进行分型检测，结合多色荧光检测，使检测通量大大提升，而传统荧光PCR法一个荧光通道只能检测一种基因型，如果采用探针法熔解曲线法一个荧光通道可以检测3种基因型甚至可以更多，使通量放大3倍。因此，亟需开发一种直接检测甲乙型流感病毒的实时荧光定量PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，本专利技术提供一种基于高分辨率溶解曲线法的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征为采用免疫磁珠与和DEAE磁珠混合得到病毒核酸提取磁珠的方法提取待检样本中RNA，然后采用Taqman探针与荧光定量PCR技术相结合的高分辨溶解曲线法进行荧光定量PCR扩增，一次性实现对流感病毒的分型检测。上述技术方案中，采用了免疫磁珠加核酸提取磁珠相结合的方法，一次性提取组织样本(咽拭子)RNA，免疫磁珠可有效富集样本中少量的流感病毒，克服组织样本提取RNA步骤繁多，导致样本病毒RNA，影响检测灵敏度的缺陷。所述的免疫磁珠包被有抗甲型流感病毒抗体和抗乙型流感病毒抗体。所述的荧光定量PCR扩增所采用的引物和探针为根据流感病毒的基质蛋白(M)基因和血凝素(HA)基因分别设计，包含有甲型流感病毒H1N1和H3N2以及乙型流感病毒Victorialineage(2008)和Yamagatalineage，分别用不同的荧光基团偶联，在不同的信道检测。所述引物和探针的序列如下：上游引物甲型流感H1-F：5’-GAGCTAAGAGAGCAATTGA-3’下游引物甲型流感H1-R：5’-GTAGATGGATGGTGAATG-3’探针甲型流感H1P：5’-Fam-TTGCTGAGCTTTGGGTATGA-3'-BHQ-1上游引物甲型流感N1-F：5’-TCCACGCCCTAATGATAA-3’下游引物甲型流感N1-R：5’-TTCTCCCTATCCAAACAC-3’探针甲型流感N1P：5’-Fam-ATCCTTTTACTCCATTTGCTCC-3'BHQ-1上游引物甲型流感H3-F：5’-AGCAAAGCCTACAGCAA-3’下游引物甲型流感H3-R：5’-GACCTAAGGGAGGCATAA-3’探针甲型流感H3P：5'-TexasRed-CCGGCACATCATAAGGGTAACA3'-BHQ-2上游引物甲型流感N2-F：5’-GTCCAACCCTAAGTCCAA-3’下游引物甲型流感N2-R：5’-GCCACAAAACACAACAATAC-3’探针甲型流感N2P：5'-TexasRed-CTTCCCCTTATCAACTCCACA-3'-BHQ-2上游引物乙型流感V-F：5’-AGACCAGAGGGAAACTATGCCC-3’下游引物乙型流感V-R：5’-TCCGGATGTAACAGGTCTGACTT-3’探针乙型流感VP：5’-Cy5-CAGACCAAAATGCACGGGGAAHATACC-3’-BHQ-3上游引物乙型流感Y-F：5’-AGACCAGAGGGAAACTATGCCC-3’下游引物乙型流感Y-R：5’-TCCGGATGTAACAGGTCTGACTT-3’探针乙型流感YP：5’-Cy5-CAGRCCAATGTGTGTGGGGAYCACACC-3’-BHQ3。所述的免疫磁珠的制备包括如下步骤，称取含有羧基基团的二氧化硅磁珠，然后依次加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温避光搅拌反应，形成活化酯磁珠；取抗甲型流感病毒抗体或抗乙型流感病毒抗体溶于PBS(磷酸缓冲盐溶液)中，将上述活化酯磁珠缓慢滴加到抗流感病毒抗体溶液中，4℃搅拌反应过夜，得到甲型流感病毒抗体的免疫磁珠或乙型流感病毒抗体的免疫磁珠，保存备用。所述的病毒核酸提取磁珠的制备包括如下步骤，称取含有羧基基团的二氧化硅磁珠，然后依次加入EDC和NHS，室温避光搅拌反应，形成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：/n将免疫磁珠和DEAE磁珠混合得到病毒核酸提取磁珠；/n使用所得的病毒核酸提取磁珠提取待检样本中的病毒核酸；/n采用Taqman探针与荧光定量PCR技术相结合的高分辨溶解曲线法对提取得到的病毒核酸进行荧光定量PCR扩增，从而实现待检样本中流感病毒的分型检测。/n

【技术特征摘要】
20200121 CN 20201007195511.一种流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：
将免疫磁珠和DEAE磁珠混合得到病毒核酸提取磁珠；
使用所得的病毒核酸提取磁珠提取待检样本中的病毒核酸；
采用Taqman探针与荧光定量PCR技术相结合的高分辨溶解曲线法对提取得到的病毒核酸进行荧光定量PCR扩增，从而实现待检样本中流感病毒的分型检测。


2.如权利要求1所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的免疫磁珠包被有抗甲型流感病毒抗体和抗乙型流感病毒抗体。


3.如权利要求1所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增所采用的引物和探针为根据流感病毒的基质蛋白M基因和血凝素HA基因分别设计，其中包括甲型流感病毒H1N1和H3N2以及乙型流感病毒Victorialineage2008和Yamagatalineage，分别用不同的荧光基团偶联，在不同的信道检测。


4.如权利要求3所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述引物和探针的序列如下：
上游引物甲型流感H1-F：5’-GAGCTAAGAGAGCAATTGA-3’
下游引物甲型流感H1-R：5’-GTAGATGGATGGTGAATG-3’
探针甲型流感H1P：5’-Fam-TTGCTGAGCTTTGGGTATGA-3'-BHQ-1
上游引物甲型流感N1-F：5’-TCCACGCCCTAATGATAA-3’
下游引物甲型流感N1-R：5’-TTCTCCCTATCCAAACAC-3’
探针甲型流感N1P：5’-Fam-ATCCTTTTACTCCATTTGCTCC-3'BHQ-1
上游引物甲型流感H3-F：5’-AGCAAAGCCTACAGCAA-3’
下游引物甲型流感H3-R：5’-GACCTAAGGGAGGCATAA-3’
探针甲型流感H3P：5'-TexasRed-CCGGCACATCATAAGGGTAACA3'-BHQ-2
上游引物甲型流感N2-F：5’-GTCCAACCCTAAGTCCAA-3’
下游引物甲型流感N2-R：5’-GCCACAAAACACAACAATAC-3’
探针甲型流感N2P：5'-TexasRed-CTTCCCCTTATCAACTCCACA-3'-BH...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凤鸣，马运国，师凤华，谭木秀，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：广西;45