一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新型冠状病毒扩增引物及其应用。该引物包括至少一个能够识别新型冠状病毒N基因上的特异区域的寡核苷酸引物，新型冠状病毒N基因上的特异区域的序列范围包括新型冠状病毒参考毒株基因组28778‑28971的区域序列。采用该引物可以快速地从血液、唾液、痰液、空气等样本提取的RNA中的检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可作为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的初筛、环境检测方法，亦可作为临床诊断的重要参考。

A novel coronavirus amplification primer and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用。
技术介绍
目前，新型冠状病毒肺炎(CoronaVirusDisease2019，COVID-19)在没有确切疗效的治疗药物和疫苗预防前提下，精准诊断、隔离病患仍是防止疫情传播最为有效的防控措施。因此，快速、特异、灵敏的病原检测对于新型冠状病毒肺炎的科学防控至关重要。COVID-19的临床诊断主要基于流行病学史，临床表现和一些辅助检查，例如核酸检测，CT扫描，免疫识别技术(IgM/IgG的即时检测(POCT)，酶联免疫吸附测定(ELISA))和血液培养。在核酸检测
，SARS-CoV-2的两种常用核酸检测技术是实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和高通量测序。SARS-CoV-2的权威鉴定方法是病毒血培养和全基因组高通量测序。然而，高通量测序技术由于其设备依赖性和成本高，在临床诊断中的应用受到限制。因此，RT-qPCR是检测呼吸道分泌物和血液中致病性病毒最常用、最有效、最直接的方法。在COVID-19爆发之初，许多公司很快推出了用于临床诊断的RT-qPCR测试试剂盒。已有报道采用两种1步RT-qPCR分析(基于TaqMan的荧光信号)分别检测病毒基因组的两个不同区域。通过该方法，阴性对照样品均被确认为阴性样品，而来自呼吸道标本的两名SARS-CoV-2感染患者样品被确认为阳性样品。另一项研究表明，使用RT-qPCR(基于非探针SYBR的荧光信号)在患者自行收集的唾液中SARS-CoV-2的阳性率为91.7％(11/12)，这表明唾液是一种有前景的非侵入性标本，可用于SARS-CoV-2感染患者的诊断，监测和感染控制。RT-qPCR检测对SARS-CoV和MERS-CoV感染也具有较高的敏感性和特异性。虽然RT-qPCR方法具有显而易见的优势，然而，该方法也存在着灵敏度低、仪器和人员依赖性强等缺点。研究表明，目前使用的RT-qPCR检测SARS-CoV的灵敏度只能达到50％-79％，这取决于使用的方案、样本类型和采集的临床样本数量。因此，提高对SARS-CoV-2感染的RT-qPCR的检测率至关重要。此外，RT-qPCR还存在其他一些缺点，包括由于患者样品的保存和操作，核酸检测操作繁琐以及结果等待时间长而带来的某些生物安全隐患，此外，该方法需要精密昂贵仪器和高素质操作人员，难以在基层检测机构推广和普及。因此，亟需开发特异性强、敏感性高兼具高效、快捷、可视化的检测产品(技术)，用于医院、社区和居家隔离、环境检测的有效补充。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比RT-qPCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)已在一定范围内得到了应用。LAMP技术依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的4条引物(2条外引物和2条内引物)和一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)。反应体系一般包括4条引物、BstDNA聚合酶缓冲液、具有链置换特性的BstDNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜碱、Mg2SO4等。该方法具有灵敏度高(比传统的PCR方法高2-5个数量级)、反应时间短(30-60min即可完成反应)、临床使用不需要特殊的仪器、操作简单(只需将反应液、酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中60-65℃左右保温30-60min，肉眼观察结果)等优点。其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中。目前，并未有用于新型冠状病毒核酸环介导等温扩增引物及其检测技术的报道。
技术实现思路
鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用。采用本专利技术的引物可以快速地从血液、唾液、痰液、空气等样本提取的RNA中的检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速、特异、敏感等优点，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可作为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的初筛、环境检测方法，亦可作为临床诊断的重要参考。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于新型冠状病毒扩增的引物，包括至少一个能够识别新型冠状病毒N基因上的特异区域的寡核苷酸引物，新型冠状病毒N基因上的特异区域的序列范围包括新型冠状病毒参考毒株基因组28778-28971的区域序列。采取上述方案的有益效果为：本专利技术提供的引物是可以用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的寡核苷酸引物，采用该引物进行环介导等温扩增检测，具有快速、简便、特异、敏感等优点。进一步，包括引物22LoopF和/或引物22LoopB，以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，引物22LoopF的序列包括与参考基因组第28834-28853位区域序列反向互补的序列；引物22LoopB的序列包括与参考基因组第28912-28930位区域一致的序列。具体的，引物22LoopF的序列可以为与参考基因组第28834-28853位区域序列反向互补的序列；引物22LoopB的序列可以为与参考基因组第28912-28930位区域一致的序列。进一步，引物22LoopF的核苷酸序列包括SEQIDNO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列包括SEQIDNO：6所示核苷酸序列。具体的，引物22LoopF的核苷酸序列可以为SEQIDNO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列可以为SEQIDNO：6所示核苷酸序列。采取上述方案的有益效果为：2LoopF和22LoopB两条引物的加入使得等温扩增的速度明显加快，并大大提高检测敏感性。进一步，包括引物22F3、引物22B3、引物22FIP、引物22BIP中的一个或任几个所述引物22FIP包括22F1c和22F2寡核苷酸片段，引物22BIP包括22B1c和22B2寡核苷酸片段以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，所述引物22F3的序列包括与参考基因组第28778-28797位区域序列一致的序列；所述引物22B3的序列包括与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补的序列；22F2寡核苷酸片段包括与参考基因组第28809-28827位区域序列一致的序列；22F1c寡核苷酸片段包括与参考基因组第28866-28885位区域序列反向互补的序列；22B1c寡核苷酸片段包括与参考基因组第28889-28910位区域一致的序列；22B2寡核苷酸片段包括与参考基因组第28932-28951位区域序列反向互补的序列。进一步，引物22F3的核苷酸序列包括SEQIDNO：1所示核苷酸序列；引物22B3的核苷酸序列包括SEQIDNO：2所示核苷酸序列；引物22FIP的核苷酸序列包括SEQIDNO：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，包括至少一个能够识别新型冠状病毒N基因上的特异区域的寡核苷酸引物，新型冠状病毒N基因上的特异区域的序列范围包括新型冠状病毒参考毒株基因组28778-28971的区域序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，包括至少一个能够识别新型冠状病毒N基因上的特异区域的寡核苷酸引物，新型冠状病毒N基因上的特异区域的序列范围包括新型冠状病毒参考毒株基因组28778-28971的区域序列。


2.根据权利要求1所述一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，包括引物22LoopF和/或引物22LoopB，以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，引物22LoopF的序列包括与参考基因组第28834-28853位区域序列反向互补的序列；引物22LoopB的序列包括与参考基因组第28912-28930位区域一致的序列。


3.根据权利要求2所述一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，引物22LoopF的核苷酸序列包括SEQIDNO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列包括SEQIDNO：6所示核苷酸序列。


4.根据权利要求1-3任一项所述一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，包括引物22F3、引物22B3、引物22FIP、引物22BIP中的一个或任几个；所述引物22FIP包括22F1c和22F2寡核苷酸片段，引物22BIP包括22B1c和22B2寡核苷酸片段；以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，所述引物22F3的序列包括与参考基因组第28778-28797位区域序列一致的序列；所述引物22B3的序列包括与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补的序列；22F2寡核苷酸片段包括与参考基因组第28809-28827位区域序列一致的序列；22F1c寡核苷酸片段包括与参考基因组第28866-28885位...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱洪伟，张兴晓，张建龙，姜琳琳，黄清荣，于馨，陈国忠，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37