一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法技术

本发明专利技术公开了一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，属于生物学技术领域。该银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，通过提取银杏幼苗、叶片、球花和种子等植株中任意可取材的器官或组织的DNA，然后通过PCR的方法准确地对银杏雌、雄株的性别进行鉴定，该发明专利技术提供的技术准确性可以达到100％，低至10mg的银杏新鲜组织就可以达到鉴定要求，不影响银杏的生长发育，而且取材的时间不受限制。

A scar marker method for early sex identification of male and Female Ginkgo biloba plants

【技术实现步骤摘要】
一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法
本专利技术属于生物学
，具体为一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法。
技术介绍
银杏为银杏科银杏属裸子植物，是我国特有树种，并被列为国家二级保护植物。银杏可果材兼用，可药用，可观赏，具有很高的经济价值。银杏是十分典型的雌、雄异株植物。由于雌株的落果、种皮具有腐臭异味，且掉落污染环境，园林上常应用雄株。银杏的种子俗称白果，是具极高经济价值的药食同源物品，故白果经济林应以雌株为主。因此，银杏种子的生产栽培与园林绿化中的资源配置都要求将银杏的雌、雄株区分开来，根据各自需要进行种植。然而银杏具有较长的童期，实生树苗定植20年左右才能开花，分辨雌雄，完全不能满足早期定植时对未成年树性别区分的特殊要求。因此，银杏雌、雄株性别的早期鉴定在生产上具有重要的实际应用价值。目前，通过形态特征、生理生化、染色体形态、同工酶、特异蛋白及化学药剂处理等现有技术方法可以在一定程度上对银杏雌雄株进行鉴定。但是这些鉴定技术方法的缺点也比较明显。通过形态特征方法鉴别银杏雌雄株的性别，相对比较简单易行，但由于不同植株形态特征差距较大，鉴定结果往往不够稳定准确。通过生理生化鉴别法易受产地、树龄、温度等多项因素影响，具有较强的波动性，且均在已知性别的成年植株之间进行分析测定，达不到早期雌雄株鉴定的要求。通过染色体形态特征鉴定法是银杏雌雄性别鉴定的重要方法之一，国内外均有对银杏染色体组成及性染色体研究的报道，但此法对于大规模鉴别银杏雌雄株而言，在生产实践中使用不够现实。通过同工酶方法进行银杏性别鉴定，稳定可靠，但规模受限，仅限于实验室研究，不适用于林业生产上大规模的雌雄鉴定。通过特异蛋白的方法对于银杏性别鉴定，比较准确，但仍需较高的科技支撑，实验步骤繁杂，条件要求较高，很难普及。通过化学药剂处理鉴别法简单易行，但仍处在定性阶段，缺乏准确的定量标准。基于分子生物学的方法，从分子水平上研究雌雄株的差异，能够对植株进行准确的性别鉴定。目前已有RAPD、AFLP、ISSR、SSR、和SCAR等种类的分子标记应用于银杏的遗传指纹图谱构建、品种鉴定和遗传育种研究。但是没有能够用于银杏雌雄株性别早期鉴定的分子标记。
技术实现思路
(一)解决的技术问题为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术提供了一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，解决了现有技术方法可以在一定程度上对银杏雌雄株进行鉴定，但是这些鉴定技术方法的缺点也比较明显，如鉴定不够准确、费时费力、不适用于大规模鉴定的问题。(二)技术方案为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，所述SCAR分子标记引物序列为GinkgoSexD-F5R5。作为本专利技术的进一步方案：所述SCAR分子标记引物序列中上游引物序列F5：GAGTTGATGTGATTCTTGGAGA，下游引物序列R5：CATTTGGTTCAAACACCTTACT。作为本专利技术的进一步方案：所述引物对在银杏雌雄株性别早期鉴定方面的应用。作为本专利技术的进一步方案：所述应用中，先是提取待鉴定样品的基因组DNA，再进行PCR扩增。作为本专利技术的进一步方案：所述待测鉴定样品基因组DNA提取方法包括以下步骤：S1、选择本地已知性别的银杏雌、雄树各10株，取其幼嫩的叶片，采用液氮速冻备用。S2、利用CTAB法提取银杏叶片DNA。作为本专利技术的进一步方案：所述PCR扩增的反应体系为：反应体积20uL，包括2×MixMaster为10uL，银杏DNA为2uL，SCAR分子标记上下游引物各0.5uL，ddH2O7uL。作为本专利技术的进一步方案：所述应用中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；循环30次；72℃延伸10min；结束反应，扩增产物置于冰箱4℃保存。作为本专利技术的进一步方案：所述PCR扩增中的PCR仪器型号不受限制，任意一台PCR仪均可完成。作为本专利技术的进一步方案：所述应用中电泳鉴定扩增产物，10株银杏雄株均能扩增出一条297bp的特异条带而10株雌株均无扩增条带，由此可鉴定银杏雌株和雄株。作为本专利技术的进一步方案：所述银杏雄株特异条带鉴定：经测序，特异条带的DNA序列为：GAGTTGATGTGATTCTTGGAGAGTAGTGGCTTAGAACACTAGAGACCTTCTCAATGAACTTAGAAGAGTTCTTCATTAAGTTTAATCTATAAGGAAAAGTGTATAAGTTGAGAGGATTGGTTGCACCACCACTAAATCAAGTAATTAATTATCATATGATGGAGAAGTTGATTAAAAAGGGTGCTACTAGCATCATTATGAGGTGCTACTCTATTGAAGGGTGTGAAGAATAGGAATCAATCACACTATAGCTACAGGAAGTTATTTCTTAACATAGTAAGGTGTTTGAACCAAATG。(三)有益效果与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：该银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，通过提取银杏幼苗、叶片、球花和种子等植株中任意可取材的器官或组织的DNA，然后通过PCR的方法准确地对银杏雌、雄株的性别进行鉴定，该专利技术提供的技术准确性可以达到100％，低至10mg的银杏新鲜组织就可以达到鉴定要求，不影响银杏的生长发育，而且取材的时间不受限制。附图说明图1为本专利技术银杏雌雄株PCR产物电泳结果，M表示基因标尺，♀表示银杏雌株，♂表示银杏雄株，10株银杏雄株均能扩增出一条297bp的特异条带而10株雌株均无扩增条带。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。如图1所示，本专利技术提供一种技术方案：一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，SCAR分子标记引物序列为GinkgoSexD-F5R5。SCAR分子标记引物序列中上游引物序列F5：GAGTTGATGTGATTCTTGGAGA，下游引物序列R5：CATTTGGTTCAAACACCTTACT。引物对在银杏雌雄株性别早期鉴定方面的应用。应用中，先是提取待鉴定样品的基因组DNA，再进行PCR扩增。待测鉴定样品基因组DNA提取方法包括以下步骤：S1、选择本地已知性别的银杏雌、雄树各10株，取其幼嫩的叶片，采用液氮速冻备用；S2、利用CTAB法提取银杏叶片DNA。PCR扩增的反应体系为：反应体积20uL，包括2×MixMaster为10uL，银杏DNA为2uL，SCAR分子标记上下游引物各0.5uL，ddH2O7uL。应用中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；循环30次；72℃延伸10min；结束反应，扩增产物置于冰箱4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其特征在于：所述SCAR分子标记引物序列为Ginkgo SexD-F5R5。/n

【技术特征摘要】
1.一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其特征在于：所述SCAR分子标记引物序列为GinkgoSexD-F5R5。


2.根据权利要求1所述的一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其特征在于：所述SCAR分子标记引物序列中上游引物序列F5：GAGTTGATGTGATTCTTGGAGA，下游引物序列R5：CATTTGGTTCAAACACCTTACT。


3.根据权利要求1所述的一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其特征在于：所述引物对在银杏雌雄株性别早期鉴定方面的应用。


4.根据权利要求3所述的一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其特征在于：所述应用中，先是提取待鉴定样品的基因组DNA，再进行PCR扩增。


5.根据权利要求4所述的一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其特征在于：所述待测鉴定样品基因组DNA提取方法包括以下步骤：
S1、选择本地已知性别的银杏雌、雄树各10株，取其幼嫩的叶片，采用液氮速冻备用；
S2、利用CTAB法提取银杏叶片DNA。


6.根据权利要求4所述的一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：反应体积20uL，包括2×MixMaster为10uL，银杏DNA为2uL，SCAR分子标记上下游引物各0.5uL，ddH2O7uL。


7.根据权利要求4所述的一种银杏雌雄株性别早期鉴定的SCAR标记方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振宁，魏僮，霍如雪，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37