一种基于PCR-RFLP快速鉴定草地贪夜蛾的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PCR‑RFLP快速鉴定草地贪夜蛾的方法。本发明专利技术通过分析草地贪夜蛾与其它近缘种在COI序列上的差异，以及草地贪夜蛾两种生物型在Tpi序列上的差异，获得了草地贪夜蛾及其生物型特异性的SNP位点，并针对其中的SNP位点设计了相应的限制性内切酶。采用基于聚合酶链式反应的限制性酶切图谱多样性分析技术(PCR‑RFLP)实现了草地贪夜蛾及其生物型的快速鉴定。为基层农业技术人员以及相关农业科研人员开展草地贪夜蛾鉴定、预测预报和防治提供了一种新的便利方法。

A PCR-RFLP based method for rapid identification of Spodoptera graminis

【技术实现步骤摘要】
一种基于PCR-RFLP快速鉴定草地贪夜蛾的方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种基于PCR-RFLP快速鉴定草地贪夜蛾的方法。
技术介绍
草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)是一种原产于南美洲的爆食性农业害虫，被列为我国重要的检验检疫对象。它具有很强的迁飞能力，扩散能力非常强。2019年1月首次在我国云南被发现。不到一年的时间，该害虫已经扩散至29个省份。目前，草地贪夜蛾在我国主要为害玉米，可造成作物减产15-73％。此外，已经发现该害虫还能够为害小麦、大豆、甘蔗等。在美国和非洲，草地贪夜蛾还能够严重为害水稻。因此，该害虫对我国水稻生产也带来了潜在的严重威胁。草地贪夜蛾目前主要在我国玉米上严重为害，与玉米上常发的其它鳞翅目害虫，如斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、黏虫等高度相似，给基层农业技术人员的测报和防治工作带来了困难。此外，草地贪夜蛾有两种不同的生物型，玉米型(Cornstrain,C型)和水稻型(Ricestrain,R型)。前者主要为害玉米、棉花、高粱等作物，后者主要为害水稻、苜蓿、狗牙根草等。两种生物型几乎不能从外表上加以区分，但它们在生理、生态、行为等方面却出现了很大的分化。例如，玉米型对二嗪农、西维因等杀虫剂具有更高的抗药性，而水稻型则对虫螨威具有更高的抗药性。此外，玉米型对转Bt基因的棉花具有更高的耐受性。这就更加需要我们准确地鉴定草地贪夜蛾的生物型，并针对性地开展测报和防治工作。以往对近缘种害虫的鉴定一般都采用DNAbarcoding(条形码)方法。即克隆线粒体细胞色素氧化酶(COI)，然后测序，并构建系统进化树进行聚类分析，最后加以鉴定。但这种方法依赖于大量的测序，不仅费时，也不经济。此外，这种方法不能用于草地贪夜蛾生物型的鉴定。COI是一种线粒体基因marker(分子标记)，属于母系遗传。因此，这种遗传标记无法对两种生物型杂交的后代进行准确的鉴定。为此，目前主要采用核基因——磷酸丙糖异构酶(Tpi)进行生物型的鉴定。NagoshiR.N.(2010)开发出了TPi上的10个SNP，根据这个10个SNP来区分水稻型和玉米型草地贪夜蛾。这个方法后来被广泛采用。然而，这种方法也高度依赖于DNA测序，同样费时、不经济。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题为：如何快速的鉴定草地贪夜蛾及其近缘种。本专利技术所要解决的第二个技术问题为：如何快速的鉴定草地贪夜蛾两种生物型。本专利技术的技术方案为：一种基于PCR-RFLP快速区分草地贪夜蛾及其近缘的方法，包括如下步骤：(1)提取待鉴定材料的基因组DNA；(2)以P1和P2为引物，步骤(1)得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到大小为697bp的COI基因片段；P1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，P2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；(3)对步骤(2)得到的COI基因片段进行两轮酶切：1)第一轮，采用Tail和AlWNI对步骤(2)得到的COI基因片段进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：同时具有347bp、263bp和87bp条带的为草地贪夜蛾和斜纹夜蛾，350bp条带的为甜菜夜蛾，697bp条带的为黏虫；2)第二轮，采用BstYI对步骤(2)得到的COI基因片段进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：同时具有587bp和110bp条带的为草地贪夜蛾，同时具有300bp和110bp条带的为黏虫，697bp条带的为斜纹夜蛾。进一步地，步骤(2)中，PCR扩增程序参数设置如下：95℃，5min；随后进行35个循环扩增(95℃，30s；54℃，30s；72℃，40s)；最后72℃补充延伸10min。进一步地，步骤(3)中，采用Tail和AlWNI对步骤(2)得到的COI基因片段进行双酶切的方法为：先加入AlWNI，37℃反应1小时；然后加入Tail，65℃反应1小时。通过上述方法，可以将斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、黏虫和草地贪夜蛾进行区分，但无法确定草地贪夜蛾的生物型。因此，本专利技术还提供了一种基于PCR-RFLP快速区分草地贪夜蛾生物型的方法，前面步骤与上述的一种基于PCR-RFLP快速区分草地贪夜蛾及其近缘的方法的技术方案一致，在鉴定出待鉴定材料为草地贪夜蛾后，进一步进行PCR扩增Tpi基因片段，然后进行BanI酶切，从条带可以分析出生物型。具体步骤如下：(1)提取待鉴定材料的基因组DNA；(2)以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到大小为638bp的Tpi基因片段；P3的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，P4的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；(3)对步骤(2)得到的Tpi基因片段进行BanI酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：具有638bp条带的为水稻型草地贪夜蛾，同时具有370bp和268bp条带的为玉米型草地贪夜蛾。进一步地，步骤(2)中，PCR扩增程序参数设置如下：95℃，5min；随后进行35个循环扩增95℃，30s；54℃，30s；72℃，40s；最后72℃补充延伸10min。进一步地，步骤(3)中，对步骤(2)得到的Tpi基因片段进行BanI酶切的条件为60℃，1小时。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术不仅能快速的区分草地贪夜蛾及其近缘(斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、黏虫)，还能区分草地贪夜蛾的生物型(水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾)，且具有省时、经济的优点，为基层农业技术人员以及相关农业科研人员开展草地贪夜蛾鉴定、预测预报和防治提供了一种新的便利方法。附图说明图1COI基因PCR扩增；图2草地贪夜蛾及其近缘种COI酶切图谱，其中(A)第一轮酶切鉴定，(B)第二轮酶切鉴定；图3Tpi基因PCR扩增；图4草地贪夜蛾两种生物型的Tpi基因酶切图谱，Rtype为水稻型，Ctype为玉米型。具体实施方式实施例1(一)提取草地贪夜蛾和三个近缘种(斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和黏虫)，以及草地贪夜蛾两种生物型(R型和C型)的基因组DNA。1)从不同地点的田间采取草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和黏虫，以及草地贪夜蛾两种生物型个体，浸泡在100％乙醇中保存；2)取适量的组织块，加入1ml2％CTAB抽提液(2％CTAB配方：100mmol/LTris-HClpH7.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl)充分匀浆，然后转移700μL匀浆液至一支新离心管中，65℃水浴45min；3)加入700μL氯仿：异戊醇(体积24：1)，上下摇动2～3min；4)12000×g离心10min；5)取大约500μL上清液，转移至一支新离心管中，加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2)上下颠倒混匀；6)加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，上下颠倒混匀；-20℃放置1h以上；7)12000×g离心10mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PCR-RFLP快速区分草地贪夜蛾及其近缘的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)提取待鉴定材料的基因组DNA；/n(2)以P1和P2为引物，步骤(1)得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到大小为697bp的COI基因片段；P1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，P2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；/n(3)对步骤(2)得到的COI基因片段进行两轮酶切：/n1)第一轮，采用Tail和AlWN I对步骤(2)得到的COI基因片段进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：同时具有347bp、263bp和87bp片段的为草地贪夜蛾和斜纹夜蛾，350bp的为甜菜夜蛾，697bp的为黏虫；/n2)第二轮，采用BstY I对步骤(2)得到的COI基因片段进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：同时具有587bp和110bp片段的为草地贪夜蛾，同时具有300bp和110bp片段的为黏虫，697bp的为斜纹夜蛾。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于PCR-RFLP快速区分草地贪夜蛾及其近缘的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待鉴定材料的基因组DNA；
(2)以P1和P2为引物，步骤(1)得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到大小为697bp的COI基因片段；P1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，P2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
(3)对步骤(2)得到的COI基因片段进行两轮酶切：
1)第一轮，采用Tail和AlWNI对步骤(2)得到的COI基因片段进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：同时具有347bp、263bp和87bp片段的为草地贪夜蛾和斜纹夜蛾，350bp的为甜菜夜蛾，697bp的为黏虫；
2)第二轮，采用BstYI对步骤(2)得到的COI基因片段进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，并对电泳结果进行拍照、分析：同时具有587bp和110bp片段的为草地贪夜蛾，同时具有300bp和110bp片段的为黏虫，697bp的为斜纹夜蛾。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增程序参数设置如下：95℃，5min；随后进行35个循环扩增95℃，30s；54℃，30；72℃，40s；最后72℃补充延伸10min。


3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄立华，江健钊，李梓钊，冯兴暴，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44