一种基于羊膜芯片的宫内感染模型建立方法技术

一种基于羊膜芯片的宫内感染模型的建立方法，所述羊膜芯片的材料为可透光透气的聚二甲基硅氧烷聚合物，聚二甲基硅氧烷单体与引发剂比例为（15~5）:1。所述羊膜芯片的结构芯片和空白芯片为不可逆封接。所述羊膜芯片由三通道的胶原微流控芯片组成，其中中间通道灌注重悬hiPSc的matrigel，两侧通道分别通入培养基，所述羊膜芯片的宫内感染，将微生物通过两侧通道入口加入。本发明专利技术应用微流控芯片为平台，首次体外构建了近生理条件的羊膜芯片的宫内感染模型，为人类孕期宫内感染的研究和药物的开发与筛选提供了重要平台。

A method of establishing intrauterine infection model based on amniotic membrane chip

【技术实现步骤摘要】
一种基于羊膜芯片的宫内感染模型建立方法
本专利技术涉及羊膜芯片的结构设计和应用
，具体涉及一种基于羊膜芯片的宫内感染模型的建立。
技术介绍
宫内感染又称先天性感染或母婴传播疾病，是指孕妇在妊娠期间受到感染而引起胎儿的宫内感染。宫内感染感染途径主要有致病微生物经胎盘垂直传播给胎儿；孕妇下生殖道致病微生物的逆行扩散；胎儿分娩时的围产期感染。宫内感染对胎儿的影响是一个复杂的问题，它与感染时的胎龄，孕妇的免疫状态、致病微生物的种类及感染的严重程度有关。一般认为妊娠早期的感染较为严重，因为这一时期是胎儿器官发育的敏感阶段。因此，孕妇在妊娠早期预防感染对保护后代的健康是非常重要的。从总的影响看，宫内感染可导致流产、先天性畸形(含先天性残疾)、死产等。目前宫内感染大部分通过临床组织切片、羊水标本等进行研究，而动物模型因其孕期与人类孕期具有巨大差异而不具有代表性，迫切需要一种体外模型来研究宫内感染。人体器官芯片指的是一种在芯片上构建的器官生理微系统，它以微流控芯片为核心，通过与细胞生物学、生物材料和工程学等多种方法相结合，可以在体外模拟构建包含有多种活体细胞、功能组织界面、生物流体和机械力刺激等复杂因素的组织器官微环境，反映人体组织器官的主要结构和功能特征。这种微缩的组织器官模型不仅可在体外接近真实地重现人体器官的生理、病理活动，还可能使研究人员以前所未有的方式来见证和研究机体的各种生物学行为，预测人体对药物或外界不同刺激产生的反应，在生命科学研究、疾病模拟和新药研发等领域具有广泛应用价值。2015年Nature杂志发表评论，称器官芯片是未来可能替代动物试验的革命性技。因此器官芯片提供了一种体外研究宫内感染的可能性。人们迫切希望获得一种基于羊膜芯片的宫内感染模型的建立方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于羊膜芯片的宫内感染模型的建立方法。其应用微流控芯片为平台，首次体外构建了近生理条件的羊膜腔的宫内感染模型，在体外接近真实地重现人体器官的生理、病理活动；为人类孕期宫内感染的研究和药物的开发与筛选提供了重要平台。本专利技术提供了一种基于羊膜芯片的宫内感染模型建立方法，其特征在于：采用三通道的羊膜芯片，其中中间胶原通道接种hiPSc细胞，同时进行原位向羊膜腔的诱导分化；该模型的构建方法的主要步骤为：(1)羊膜芯片的制备：采用常规的光刻蚀制作SU-8聚合物模板，将未固化PDMS聚合物溶液倾倒入SU-8聚合物模板和空白模板中，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离固化PDMS聚合物芯片，将带结构的PDMS聚合物芯片打孔后，将结构芯片1和空白芯片2通过不可逆封接键合为羊膜芯片，将羊膜芯片高温高压灭菌后放入培养皿中使用。(2)羊膜的诱导与分化：将重悬了hiPSc细胞于matrigel从胶原通道3入口处灌入芯片中，将芯片放于37摄氏度培养箱中使matrigel固化5-20分钟，固化完成后，在芯片的两侧通道中加入mTesR1培养基，每天换液。(3)宫内感染：宫内感染为大肠杆菌的感染，将大肠杆菌以1X107CFU/ml的密度重悬于mTesR1培养基中，并灌入芯片两侧的培养基通道4中；放于37摄氏度培养箱中分别培养24小时、48小时。所述羊膜芯片由结构芯片1和空白芯片2上下不可逆封接，所述结构芯片1包括三个通道，中间为胶原通道3，两侧均为培养基通道4，所述胶原通道3和两侧的培养基通道4均通过PDMS微柱5分开。所述PDMS微柱5通过两次曝光制作，具体步骤为：第一次在干净的玻璃片上涂布一层SU-8光刻胶，进行全曝光，第二次在已曝光的SU-8聚合物模板，涂布一层SU-8光刻胶，进行微柱结构的曝光，得到PDMS微柱5。所述羊膜芯片的材料为可透光透气的聚二甲基硅氧烷聚合物，其中聚二甲基硅氧烷单体与引发剂比例为15～5:1。所述PDMS微柱5底部与下层空白芯片2的距离为100-300微米，PDMS微柱5厚度为300-600微米。本专利技术提供了一种基于羊膜芯片的宫内感染模型的建立方法，其特征在于：使用三通道的胶原微流控芯片构建羊膜芯片的宫内感染模型，所述微流控芯片的结构芯片1和空白芯片2为不可逆封接。本专利技术优点：以微流控芯片为平台，原位诱导3D羊膜腔，研究早期羊膜腔宫内感染的一系列病理活动，为人类孕期宫内感染的研究和药物的开发与筛选提供了重要平台。附图说明下面结合附图及实施方式对本专利技术作进一步详细的说明：图1为羊膜芯片掩膜示意图；图2为羊膜芯片纵切结构示意图；图3为人诱导多能干细胞来源的羊膜腔发育图：图4为显微镜下观察大肠杆菌感染羊膜腔24小时的明场图片和死/活染色荧光图；图5为显微镜下观察大肠杆菌感染羊膜腔48小时的明场图片；其中，结构芯片1、空白芯片2、胶原通道3、培养基通道4、PDMS微柱5。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围不受实施例的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述
技术实现思路
对本专利技术做出一些非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。实施例1羊膜芯片制作：利用光刻蚀技术制作SU-8聚合物模板，采用常规的光刻蚀技术制作SU-8模板：将SU-8光刻蚀胶涂于干净的玻璃片上，95摄氏度前烘加热1小时后，去除有机试剂，待SU-8光刻胶冷却后；放上设计好的掩膜在紫外下曝光30秒后，95摄氏度后烘加热15分钟；待SU-8光刻胶冷却后，在涂一层SU-8光刻胶，95摄氏度前烘2h，去除有机试剂，待SU-8冷却后，放上第二层设计好的掩膜，与第一层掩膜对齐，在紫外下曝光50s，95摄氏度后烘加热15分钟，完全显影，180摄氏度烘箱中坚膜2小时，自然降至室温。将未固化的PDMS(体积比10：1)倾倒在制作好的SU-8聚合物模板上，并同时在85℃下加热固化40分钟。装置冷却后，剥离上层PDMS结构芯片1。将未固化的PDMS倾倒于干净的玻璃片上，并同时在85℃下加热固化40分钟，装置冷却后，剥离上层PDMS空白芯片2。将PDMS结构芯片1和空白芯片2切割成相同尺寸，利用等离子技术，不可逆封接PDMS结构芯片和空白芯片即形成羊膜腔芯片。细胞接种和诱导：将芯片高压灭菌后，放于培养皿中，用移液枪将重悬有hiPSc的martigel从芯片的中间胶原通道3入口灌入，然后将芯片放于37摄氏度培养箱中10分钟，让matrigel固化，10分钟后将芯片的两侧培养基通道4中灌满培养基，放于37摄氏度培养箱中培养，每天换液。大肠杆菌处理：待羊膜芯片培养7天后，将大肠杆菌以1x107CFU/ml密度重悬于培养基中，将芯片中两侧培养基通道4中的培养基都吸走，灌注上重悬了大肠杆菌的培养基，放置于37摄氏度培养箱中分别培养24小时、48小时后染死活染色，观察大肠杆菌感染羊膜腔的细胞活性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于羊膜芯片的宫内感染模型建立方法，其特征在于：采用三通道的羊膜芯片，其中中间胶原通道接种hiPSc细胞，同时进行原位向羊膜腔的诱导分化；该模型的构建方法的主要步骤为：/n(1)羊膜芯片的制备；/n(2)羊膜的诱导与分化；/n(3)宫内感染。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于羊膜芯片的宫内感染模型建立方法，其特征在于：采用三通道的羊膜芯片，其中中间胶原通道接种hiPSc细胞，同时进行原位向羊膜腔的诱导分化；该模型的构建方法的主要步骤为：
(1)羊膜芯片的制备；
(2)羊膜的诱导与分化；
(3)宫内感染。


2.按照权利要求1所述基于羊膜芯片的宫内感染模型的建立方法，其特征在于：所述羊膜芯片由结构芯片(1)和空白芯片(2)上下不可逆封接，所述结构芯片(1)包括三个通道，中间为胶原通道(3)，两侧均为培养基通道(4)，所述胶原通道(3)和两侧的培养基通道(4)均通过PDMS微柱(5)分开。


3.按照权利要求2所述的羊膜芯片的宫内感染模型建立方法，其特征在于：所述PDMS微柱(5)通过两次曝光制作，具体步骤为：第一次在干净的玻璃片上涂布一层SU-8光刻胶，进行全曝光，第二次在已曝光的SU-8聚合物模板，涂布一层SU-8光刻胶，进行微柱结构的曝光，得到PDMS微柱(5)。


4.按照权利要求1所述基于羊膜芯片的宫内感染模型建立方法，其特征在于：所述羊膜芯片的材料为可透光透气的聚二甲基硅氧烷聚合物，其中聚二甲基硅氧烷单体与引发剂比例为15～5:1。


5.按照权利要求3所述基于羊膜芯片的宫内感染模型建立方法，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，尹方超，王慧，赵孟乾，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21