同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的试剂及方法技术

本发明专利技术涉及一种快速高效分离动物细胞蛋白质和RNA的提取试剂和方法。利用细胞裂解液和苯酚氯仿抽提法，通过优化提取条件，实现从细胞质或细胞核中同步分离蛋白质和RNA的目的。该方法适用于少量或珍贵细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。

Reagents and methods for simultaneous separation of proteins and RNA from cytoplasm and nucleus

【技术实现步骤摘要】
同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的试剂及方法
本专利技术属于细胞生物学蛋白提取
，涉及一种利用细胞裂解液和苯酚氯仿抽提法，从细胞质或细胞核中同步分离蛋白质和RNA的提取试剂和方法，该方法适用于少量细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。
技术介绍
随着精准医学和肿瘤生物学的快速发展，从大量临床样本中获取更多的疾病遗传信息受到越来越多的关注。整合蛋白质组学、转录组学以及代谢组学信息，可以全面的了解疾病发生发展的规律，为临床治疗寻找药物作用靶点。然而，由于试验样本有限，有时候不能同步提取DNA、RNA、蛋白质或代谢物，结果造成样本信息不对等，引起试验结果偏差较大等实际问题。因此，为了充分利用试验样本，从相同样本中同时获取蛋白、核酸或代谢物等信息，获取更多有价值的遗传背景信息，很多试剂公司或研究人员都致力于开发一些可以同步提取蛋白、核酸或代谢物的试剂或方法。近些年蛋白质的提取方法主要包括水溶液提取法和有机溶剂提取法。前者适合提取大部分可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液的蛋白质，后者用来提取少数与脂类结合的蛋白质，常用有机溶剂包括乙醇、丙酮或丁醇等。提取出来的蛋白质可通过盐析、等电点沉淀、离子交换层析或亲和层析等方法进行分离。目前分离动物细胞蛋白质的试剂主要包括RIPA试剂，根据表面活性剂种类和比例不同，又分为强、中、弱细胞裂解液，适用于提取胞浆、胞核或细胞膜蛋白，满足后续WB或IP等实验要求。常用的表面活性剂有SDS、TritonX-100和NP-40等。现阶段RNA提取试剂主要包括Trizol、RNAiso等试剂，其内含异硫氰酸胍和酚等物质，能迅速破碎细胞和溶解细胞中的其它成分，抑制细胞释放出核酸酶，维持细胞中RNA的稳定。当加入氯仿离心后，RNA进入水相，再用异丙醇沉淀水相中的RNA，即可达到提取总RNA的目的。该法所提RNA纯度高，完整性好，可用于定量PCR、NorthernBlot、体外翻译和分子克隆等实验。尽管有关蛋白质或RNA的提取试剂很多，提取方法比较成熟，但是可以同步分离蛋白质和RNA或DNA的试剂却很少，提取方法不够成熟，不能满足少量或珍贵细胞样本的实验要求，亟待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的：一是提供一种高效快速地从动物细胞质或细胞核中提取总蛋白和RNA的提取试剂；二是利用上述提取试剂建立一种同步提取蛋白质和RNA的实验方法，可从少量或珍贵实验样本中同时分离细胞总蛋白和RNA，用于同步研究细胞蛋白组和转录组，节约细胞样本、获取很多有效数据。本专利技术的技术方案如下：一种快速高效提取动物细胞总蛋白和RNA的提取试剂，包括以下三种组分：试剂A：包括20mMTris-HCl(pH7.4)、10mMNaCl、3mMMgCl2、0.1％NP40、1mMEDTA(pH8.0)和10％Glycerol，使用前添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和RNA分解酶抑制剂(现用现配)。试剂B:100mMTris-HCl(pH7.4)、2mMNa3VO4、100mMNaCl、1％TritonX-100、1mMEDTA、10％Glycerol、1mMEGTA、0.1％SDS、1mMNaF、0.5％deoxycholate和2mMNa4P2O7。试剂C：包含质量浓度为0.1％异硫氰酸胍盐和0.2％β-巯基乙醇的水饱和苯酚溶液；一种利用上述提取试剂同步提取细胞质或细胞核蛋白和RNA的方法，包括以下步骤：1、配制提取试剂A、B和C。使用前在试剂A和C中分别添加1％的磷酸酶抑制剂、1％蛋白酶抑制剂和1U//μlRNase分解酶抑制剂(现用现配)；2、准备实验样品。按照常规方法收集细胞(1×106～5×106)。使用预冷PBS清洗细胞两次。离心1000rpm×5min×4℃，收集细胞沉淀；3、添加500μl提取试剂A，冰上静置60min，每10分钟混匀一次，充分裂解细胞；4、离心3000rpm×10min×4℃，上清液中含有细胞质蛋白及RNA，而沉淀中含有细胞核蛋白及RNA；5、添加PBS清洗沉淀两遍，可用移液枪轻缓吹打。离心3000rpm×10min×4℃，收集沉淀；6、向沉淀中添加25μl试剂B，放置在冰上裂解30min，每10分钟涡悬震荡30s，重复三次；7、离心14000rpm×20min×4℃，上清液中含有细胞核蛋白和RNA提取物；同步提取细胞质或细胞核中的RNA，具体步骤如下：8、吸取上述步骤4的细胞质裂解液200μl、步骤7的细胞核裂解液50μl，分别添加600μl、150μl试剂C(3倍体积)，混合均匀，室温静置5min；9、加入总体积20％的氯仿，涡悬震荡混匀，室温静置10min；10、离心12000rpm×10min×4℃，将上清液转移到新的无RNA分解酶的无菌离心管中；11、加入与上清液等体积的异丙醇后，混合均匀，室温静置10min；12、离心12000rpm×10min×4℃，保留沉淀，添加500μl75％乙醇清洗沉淀；13、离心8000rpm×5min×4℃，保留沉淀；14、室温干燥沉淀。添加DEPC处理水溶解RNA。该方法适用于少量或珍贵细胞样本开展蛋白功能研究及RNA检测分析。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：一、现有的蛋白质提取试剂和RNA提取试剂通常是分开使用的，不能同时提取蛋白质和RNA，操作步骤繁琐，需要较多实验样本，不适合少量或珍贵细胞样本的检测分析。本专利技术通过优化提取液配方、改进实验流程，将细胞蛋白质和RNA提取方法融合在一起，可以同时分离细胞蛋白质和RNA，简化了实验步骤，节约实验样本，提高工作效率。二、与Trizol试剂相比，本方法通过优化细胞裂解液配方、调整细胞破碎时间，优先分离出细胞质蛋白和RNA，然后再分离出细胞核蛋白和RNA，保证了蛋白质活性和RNA完整性，可用于后续的蛋白组功能研究及转录组分析检测。附图说明图1利用本专利技术试剂同步分离提取细胞质/细胞核蛋白和RNA的实验流程图；图2利用本专利技术方法提取的细胞质和细胞核蛋白，免疫印迹检测结果(WesternBlotting)。利用凯基生物商品化细胞质/细胞核蛋白提取试剂和本专利技术提取试剂，分别提取肝癌细胞SMMC7721细胞质和细胞核蛋白，并进行Westernblotting检测。结果表明，商品化试剂盒和本专利技术试剂都可以很好的分离出细胞质蛋白，纯度很好(核蛋白LambinB没有出现在细胞质蛋白中)；但是商品化试剂盒分离的细胞核蛋白有少量胞质蛋白残留(如箭头所示，胞质蛋白Tubulin出现在胞核蛋白中)，而利用本专利技术提取试剂分离的胞核蛋白中没有出现胞质蛋白Tubulin残留，说明本专利技术试剂在去除细胞核蛋白残留方面效果更好。图3利用本专利技术试剂和提取方法获取的细胞质和细胞核RNA，进行qRT-PCR检测结果。利用本专利技术方法提取的细胞质和细胞核RNA，进行qRT-PCR检测。结果表明，RNA纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的试剂，主要包括下述三种组分：/n试剂A：包含20mM～100mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM～100mM NaCl、1mM～10mM MgCl

【技术特征摘要】
1.同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的试剂，主要包括下述三种组分：
试剂A：包含20mM～100mMTris-HCl(pH7.4)、10mM～100mMNaCl、1mM～10mMMgCl2、体积浓度0.1％～1％NP40、1mM～10mMEDTA(pH8.0)和体积浓度1％～10％Glycerol；
试剂B包含10mM～100mMTris-HCl(pH7.4)、1mM～5mMNa3VO4、10mM～100mMNaCl、0.1％～1％TritonX-100、1mM～10mMEDTA、体积浓度1％～10％Glycerol、1mM～10mMEGTA、质量浓度0.1％～10％SDS、1mM～10mMNaF、质量浓度0.1％～0.5％Deoxycholate和1mM～10mMNa4P2O7；
试剂C包含质量浓度为0.1～1％异硫氰酸胍盐和0.1～0.5％β-巯基乙醇的水饱和苯酚溶液。


2.同步分离细胞质和细胞核中蛋白质和RNA的方法，采用权利要求1所述提取试剂进行提取，利用细胞裂解液和苯酚氯仿抽提法，实现同步分离细胞蛋白质和RNA的目的；
(1)在提取细胞蛋白质和RNA前，需要在试剂A和C中分别添加终体积浓度1％磷酸酶抑制剂、终体积浓度1％蛋白酶抑制剂和终浓度1U/ulRNase分解酶抑制剂；
(2)准备新鲜细胞样品，离心收集细胞(1×106～5×106)，添加1～2mlPBS缓冲液清洗两遍；
(3)添加0.1～1ml提取试剂A，冰上(范围-4℃～4℃)裂解细胞60min，释放出细胞质蛋白和RNA；
(4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梅，陈欢，朴海龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21