本发明专利技术属于生物技术及基因工程领域，具体公开了一种邻苯二酚1,2‑双加氧酶基因及其在在合成4位取代顺，顺‑粘康酸中的应用。所述的苯二酚1,2‑双加氧酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因表达的产物邻苯二酚1,2‑双加氧酶，能高效催化4位取代儿茶酚生成相应的4位取代顺，顺‑粘康酸。本发明专利技术还提供了一种利用分批补料策略进行全细胞催化制备4位取代顺，顺‑粘康酸的方法，该方法过程简单、反应条件温和以及对环境友好，符合绿色发展经济的道路的概念，为安全大批量生产提供了简单便捷的途径。
A catechol 1,2-dioxygenase gene and its application in the synthesis of 4-substituted CIS, cis-mykonic acid
【技术实现步骤摘要】
一种邻苯二酚1,2-双加氧酶基因及其在在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用
本专利技术属于生物技术及基因工程领域，涉及一种邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因在合成4位取代顺，顺-粘康酸(4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸)中的应用，具体涉及一株表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组菌及其全细胞催化合成4位取代顺，顺-粘康酸的方法。
技术介绍
粘康酸，又称己二烯二酸，可以用作树脂、医药、食品和农药的基础原料，被认为是一种很有价值的中间体，可用来生产如己二酸，对苯二甲酸这样的大宗化学品。这两种产品可以用来制造尼龙-66、工业塑料、聚酯合成纤维等。由于高分子主链具备一定的规整性，尼龙大多数呈现白色半透明外观，透明性不好限制了它在某些方面的使用，通过引入含侧基或环结构的单体，破坏分子链规整性，可得到透明尼龙。因此，开发能够高效催化合成含侧基的顺，顺-粘康酸的邻苯二酚1,2-双加氧酶(CatA)具有重要的意义，其中底物含侧基的儿茶酚(如4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚)可从廉价、可再生的生物质资源中获得，从而使得工艺流程具有满足绿色工业的发展需求的潜能。节杆菌主要存在于土壤和某些极端环境中，其对多种压力环境有显著的耐受性，能在复杂的环境中降解多种污染物，包括多种苯衍生物、多环芳香族化合物、硝化甘油等多种化合物。近年来，多株节杆菌基因组序列的获得，为节杆菌代谢机制的解析和功能基因的挖掘提供了研究基础。目前尚无利用节杆菌CatA催化生产4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸方法的报道。大肠杆菌培养条件简单、周期短，利用高效表达节杆菌CatA的大肠杆菌工程菌株，以4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚为原料全细胞催化合成相应的4位取代顺，顺-粘康酸，且全细胞催化无需酶的分离和提纯等操作，易于大规模生产，同时天然的细胞环境有利于保持酶的稳定性。此途径反应体系简单、条件温和、环境友好，在制备生物基透明尼龙产品方面，具有潜在的工业应用价值。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种邻苯二酚1,2-双加氧酶的编码基因。本专利技术还要解决的技术问题是提供含有上述邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因的重组载体。本专利技术进一步要解决的技术问题是提供含有上述重组载体的重组菌。本专利技术进一步要解决的技术问题是提供上述重组菌在表达邻苯二酚1,2-双加氧酶中的应用。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述重组菌在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种邻苯二酚1,2-双加氧酶(CatA)编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。其中，该CatA编码基因长度为885bp，编码294个氨基酸和1个终止密码子，编码的CatA以含侧基的儿茶酚(如4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚)为底物合成相应4位取代顺，顺-粘康酸。所述CatA编码基因来自于节杆菌Arthrobactersp.CGMCC3584，该菌株已公开于中国专利技术专利申请201010191515.6中。含有上述邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因的重组载体也在本专利技术的保护范围之内；其中，所述的重组载体为融合表达载体。优选地，所述重组载体的出发载体为pET28a。上述重组载体的制备方法为：利用一步克隆法将CatA编码基因片段插入出发载体pET28a的NdeI和EcoRI酶切位点之间得到重组载体pET28a-ArcatA，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。含有上述重组载体的重组菌也在本专利技术的保护范围之内。优选地，所述重组菌的宿主菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。上述重组菌的构建方法包括如下步骤：将重组载体pET28a-ArcatA通过热击法转化至E.coliBL21(DE3)中，即得重组菌。上述重组菌在表达邻苯二酚1,2-双加氧酶中的应用也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的应用包括如下步骤：(i)将重组菌活化后得到的种子液接种到培养基中，培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为0.05-1.0mM(优选0.2mM)，诱导表达后，离心收集菌泥；(ii)将上述收集的菌泥用100mMTris-HCl(pH8.0)清洗两遍，然后加入10mL的100mMTris-HCl(pH8.0)重悬，超声破碎，离心得到的上清即为粗酶液。上述重组菌在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用也在本专利技术的保护范围之内；其中，所述的4位取代顺，顺-粘康酸优选为4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸。其中，所述的应用包括如下步骤：(1)将重组菌活化后得到的种子液接种到培养基中，培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为0.05-1.0mM(优选0.2mM)，诱导表达后，离心收集菌泥；(2)全细胞催化：向Tris-HCl缓冲液中添加4位取代儿茶酚和步骤(1)得到的菌泥，建立全细胞催化反应体系，进行全细胞催化反应，生成4位取代顺，顺-粘康酸；或进行酶催化，即将步骤(1)得到的菌泥进行超声破碎，离心，得到含邻苯二酚1,2-双加氧酶的粗酶液；向Tris-HCl缓冲液中添加粗酶液和4位取代儿茶酚，建立酶催化反应体系，进行酶催化反应，生成相应4位取代顺，顺-粘康酸。步骤(1)中，重组菌活化后得到的种子液的制备方法为将重组菌接种到至含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，即得。步骤(1)中，将重组菌种子液按照1％的体积比接种到LB液体培养基中。步骤(1)中，所述的诱导表达为在20℃，150rpm诱导表达2-10h(优选8h)。步骤(2)中，所述的Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为50-100mM；4位取代儿茶酚的终浓度为10-90mM。步骤(2)中，所述的全细胞催化反应体系中，菌泥的终浓度为5-20g/L；所述的酶催化反应体系中，粗酶液的终用量为0.1-1U/mL。优选地，所述的Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl的浓度为100mM；4位取代儿茶酚的浓度为10mM；菌泥的用量为10g/L；粗酶液的终用量为0.262U/mL。其中，所述的4位取代儿茶酚优选为4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚。步骤(2)中，粗酶液的制备方法具体为将步骤(1)得到的菌泥用100mMTris-HCl清洗后，再重悬于10mL的100mMTris-HCl中，超声破碎后，离心，所得上清液即为粗酶液；其中，每200mL种子液处理后，离心得到的菌泥，重悬于10mL的100mMTris-HCl中。酶活定义如下：在30℃下每分钟转化1微摩尔底物儿茶酚所需的酶量定义为一个酶活单位U。步骤(2)中，所述的全细胞催化反应和酶催化反应均为在pH6.0-10.0，20-45℃反应1-9h；优选地，所述的全细胞催化反应和酶催化反应均为在pH8.0，30℃下反应9h。更优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.含有权利要求1所述邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pET28a。
4.含有权利要求2或3所述重组载体的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.权利要求5所述的重组菌在表达邻苯二酚1,2-双加氧酶中的应用。
7.权利要求5所述重组菌在合成4位取代顺，顺-粘康酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将重组菌种子液接种到培养基中，培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入IPTG，诱导表达后，离心收集菌泥；
(2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，宋佳睿，牛欢青，冷静，胡瑞佳，朱晨杰，陈勇，柳东，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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