一种应用性能提高的脲酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种应用性能提高的脲酶突变体。通过定点突变将野生型脲酶的第325位甲硫氨酸突变为缬氨酸，或将第373位甲硫氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸。脲酶突变体M325V，M373A和M373T的K

A urease mutant with improved application performance

【技术实现步骤摘要】
一种应用性能提高的脲酶突变体
本专利技术涉及一种应用性能提高的脲酶突变体，属于基因工程和酶工程

技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate，EC)是一种在传统发酵食品中检测出的氨类危害物。2007年EC被IARC正式归类为2A类致癌物质，即对人类很可能有致癌性。在酒精饮料中，EC主要由尿素和乙醇反应生成。目前消除黄酒中的EC主要有三种策略。策略一：工艺优化法，主要集中在三个方面，1、对原材料的精炼，减少原材料中的尿素；2、对酒精饮料发酵过程进行优化，减少因菌株代谢及酶促反应而生成的前体物质；3、对酒精饮料后处理过程进行优化，比如缩短灭菌加热时间、加快灭菌后的降温速度等。策略二：代谢工程改造法，利用代谢工程技术改造酿酒酵母，使其在发酵过程中减少尿素和EC的生成。策略三：微生物酶法，氨基甲酸乙酯水解酶可以降解EC生成氨、二氧化碳和乙醇，但其在酸性条件及高浓度乙醇的条件下不稳定，导致氨基甲酸乙酯水解酶难以应用于酒精饮料中。脲酶具有尿素酶和氨基甲酸乙酯降解酶两种酶的活性，利用脲酶同时降解EC及其前体尿素被认为是最有希望彻底消除酒精饮料中EC的方法。提高脲酶对氨基甲酸乙酯的亲和力及降解率对于推动脲酶应用于黄酒中降解氨基甲酸乙酯具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种应用性能提高的脲酶突变体及其应用。本专利技术提供的应用性能提高的脲酶突变体是以来源于解淀粉芽孢杆菌、氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的脲酶为亲本，在亲本脲酶氨基酸的基础上，将其第325位或第373位进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述亲本脲酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，将亲本脲酶氨基酸的第325位甲硫氨酸突变为缬氨酸，将第373位的甲硫氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸，得到脲酶突变体M325V、M373A、M373T。在本专利技术的一种实施方式中，所述脲酶突变体M325V、M373A、M373T的氨基酸序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7所示，编码所述脲酶突变体M325V、M373A、M373T的核苷酸序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8所示。本专利技术提供一种所述的脲酶突变体的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)质粒构建：设计突变所用引物，以脲酶亲本基因为模板进行突变并构建突变体的质粒载体；(2)突变菌株构建：将突变质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，得到重组突变菌株；(3)目标蛋白的表达：挑选含有脲酶突变基因的突变菌株进行发酵培养、诱导、纯化，进而获得脲酶突变体的蛋白，用于后续实验。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中所述的大肠杆菌为BL-21。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)为所述重组菌株30～40℃培养至OD600为0.6～1.2时加入0.01～0.6mM的IPTG和3～10mM的Ni2SO4诱导酶的表达，诱导温度为25～35℃，诱导时间10～20h得到发酵液；再将发酵液进行破碎、过滤、纯化，得到脲酶突变体。本专利技术提供了一种表达所述脲酶突变体M325V、M373A、M373T基因的重组表达载体，所述重组表达载体为pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1或pCDFDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。本专利技术提供了一种表达所述脲酶突变体的宿主细胞，所述宿主细胞包括枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、大肠杆菌。本专利技术提供一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯的方法，所述方法是将脲酶突变体M325V、M373A、M373T添加至含有氨基甲酸乙酯的培养基中进行处理。在本专利技术的一种实施方式中，所述脲酶突变体的添加量为3000～10000U/L，在30～40℃下反应40～60h。在本专利技术的一种实施方式中，所述脲酶突变体的添加量为5000～70000U/L，在35～40℃下反应45～55h。本专利技术提供了一种所述脲酶突变体在降解食品中的尿素及氨基甲酸乙酯中的应用，所述食品包括发酵酒精饮料。本专利技术还提供了所述突变体、基因、宿主细胞或表达载体在降解食品中的尿素及氨基甲酸乙酯中的应用，所述食品包括发酵酒精饮料。本专利技术的有益效果：本专利技术通过对来源于解淀粉芽孢杆菌JP-21的脲酶进行改造，通过定点突变将野生型脲酶UreC亚基的第325位甲硫氨酸突变为缬氨酸，或将第373位甲硫氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸，突变后的脲酶提高了对EC的亲和力，Km相较于野生型脲酶分别降低了41.24％，50.82％和37.47％；同时还提高了脲酶对黄酒中氨基甲酸乙酯的降解率，较野生型脲酶分别提高了64％、50％和94％。附图说明图1为脲酶及其突变体温度的稳定性。图2为脲酶及其突变体的最适pH。图3为脲酶及其突变体的pH稳定性。图4为脲酶及其突变体的乙醇耐受性。图5为脲酶及对黄酒中尿素和氨基甲酸乙酯的降解量；*和**代表显著差异(p<0.05)和及其显著差异(p<0.01)；尿素+和EC+分别为热处理结束之后黄酒中的尿素和EC含量。具体实施方式LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4mL/L，磷酸盐溶液：KH2PO40.017mol/L，H2KPO40.017mol/L，磷酸盐溶液与其他组分在121℃下分开灭菌20min。20mmol/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液：5.8g/LNa2HPO4·12H2O，0.5928g/LNaH2PO4·2H2O，8.5g/LNaCl。尿素测定：先采用二乙酰单氧化反应法处理样品，再利用高效液相色谱法进行测定(参见文献Determinationofureausinghigh-performanceliquidchromatographywithfluorescencedetectionafterautomatedderivatisationwithxanthydrol)。EC测定：采用固相微萃取法处理样品，再利用GC-MS的方法进行测定(参见文献DeterminationofECcontentinricewinebyGC/MSandHPLC-FLD.FoodandFermentationIndustries)。实施例1：含脲酶基因重组菌的制备使用引物P1-F/P1-R，用PCR的方法对质粒pRSF-Duet-1进行线性化，PCR反应体系为：2×PhantaMaxMasterMix25μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，模板DNA1μL，ddH2O20μL(PCR试剂购自于南京诺唯赞生物科技有限公司)，得到线性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脲酶突变体，其特征在于，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脲酶为亲本脲酶，将亲本脲酶氨基酸的第325位或第373位进行突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种脲酶突变体，其特征在于，是以氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的脲酶为亲本脲酶，将亲本脲酶氨基酸的第325位或第373位进行突变。


2.根据权利要求1所述的脲酶突变体，其特征在于，将亲本脲酶氨基酸的第325位甲硫氨酸突变为缬氨酸，或将373位的甲硫氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸。


3.编码权利要求1或2所述脲酶突变体的基因。


4.表达权利要求1或2所述脲酶突变体的宿主细胞。


5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特在在于，所述宿主细胞为真菌或细菌。


6.携带权利要求3所述基因的表达载体。

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【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，贾云耀，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32