无核荔枝嫁接砧木选择方法技术

本发明专利技术公开了无核荔枝嫁接砧木选择新技术。发明专利技术步骤：一）、采用选择性扩增微卫星（ＳＡＭ）结合数据库搜索法分离简单序列重复（ＳＳＲ）序列；二）、用简单序列重复（ＳＳＲ）序列的侧翼序列设计ＳＳＲ引物；三）、筛选有用引物，获得荔枝特异性的简单序列重复（ＳＳＲ）标记；四）、应用荔枝特异性的简单序列重复（ＳＳＲ）标记对部分荔枝种质进行遗传多样性分析；五）、数据分析；六）、根据数据分析结果，挑选亲缘关系近的荔枝种质作砧木进行无核荔枝的嫁接繁殖。通过无核荔枝嫁接砧木选择新技术进行无核荔枝的嫁接繁殖，使无核荔枝的接穗嫁接亲和力好、繁殖形成同质的无性系，成活率高达９５％。无核荔枝品种与妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、种核退化、风味口感上佳等优点。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及果树嫁接
，具体涉及一种应用简单序列重复(SimpleSequence Repeat，简称SSR)分子标记解决无核荔枝嫁接不亲和问题的技术方法
技术介绍
荔枝(Litchi chinensis Sonn.)为无患子科(Sapindaceae)荔枝属(Litchi)植物，因其果实色泽鲜艳、肉质细嫩多汁、香甜可口而享誉中外，有“人间仙果”、“佛果”、“果王”的美称。荔枝果肉的营养价值高，每100克果汁中含维生素C 36毫克、蛋白质0.7克、脂肪0.6克、碳水化合物14克，产生热能267.7760千焦。中医认为，荔枝味酸，性平偏温，具有生津止渴、补气养血、理气止痛等功效，尤其对病后体虚、气血不足、胃脘胀痛、胃阴不足及口渴咽干等症具有神奇的医疗保健作用。因此民间常把荔枝作为药疗补品食用。除了用作食品外，其果实还可以用来酿酒；其花芳香多蜜，是理想的蜜源植物；树皮、果皮、树根含有大量单宁，可以工业用；百年荔枝的树干是上好的木材，称为“中国酸枝木”，非常珍贵。由于荔枝用途广泛、经济价值高，因此在我国水果业中具有重要的地位。无核荔枝目前已在海南开始种植，但是其中有个严重的问题。用普通黑叶或其它荔枝实生苗作砧木进行嫁接繁殖，由于不亲和现象突出，导致成活率很低，不到5％。显然，嫁接不亲和的问题已成为无核荔枝大面积推广种植的限制因素。其实，不仅无核荔枝存在着严重的嫁接不亲和问题，其它荔枝主栽品种在繁殖的时候，也存在一定的嫁接不亲和现象。主要症状有①嫁接口肿大，上大下小明显，愈合不正常；②嫁接口愈合基本正常，也有1～2次正常梢次，但以后只在梢端簇生短小枝梢，甚至抽生短小花穗，不能结果；③定植后苗木变黄，不能抽梢，长时间维持生而不长的状况；④原来生长正常并已结果多年，随着时间的推移，逐步表现嫁接口上下生长不平衡而出现地上部黄化、衰退的现象。像这些嫁接不亲和的植株应该在早期就进行鉴定，然而传统的砧穗搭配试验周期长，成本高，难以快速有效地解决这个问题。而现代分子标记技术给迷茫中的我们带来了希望。影响荔枝嫁接亲和性的因素很多，有遗传因素、形态解剖学的因素和生理生化的因素，但主要是亲缘关系的影响。一般认为，砧木与接穗的亲缘关系越近，其形态结构和生理代谢途径就越相似，嫁接面也就越容易愈合。基于这种考虑，我们开展了荔枝SSR分子标记的研究工作，并用自己开发的荔枝SSR标记对荔枝种质，包括无核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的亲缘关系进行了分析，从中找到了适于无核荔枝进行嫁接繁殖的砧木。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种无核荔枝嫁接砧木选择新技术，即开发荔枝特异的SSR分子标记，用于鉴定和筛选与无核荔枝亲缘关系相近的种质材料，确定最优接穗/砧木组合，有效解决无核荔枝嫁接不亲和问题；荔枝嫁接砧木选择新技术，应用荔枝特异SSR分子标记分析荔枝种质获得一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合；荔枝特异SSR分子标记采用以下技术步骤获得一)、任用一种荔枝品种为材料采用选择性扩增微卫星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，简称SAM)法结合数据库搜索法分离简单序列重复(SimpleSequence Repeat，简称SSR)序列；二)、用SSR的侧翼序列设计SSR引物采用Primer Premier 5.0软件设计特异引物；引物设计参数为引物长度(18-24nt)、3’端稳定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；三)、筛选有用引物，获得荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。采用与步骤1相同的荔枝品种作材料，以其基因组DNA为模板，更换不同的简单序列重复(SSR)引物进行扩增；采用以下反应程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火温度1分15秒、72℃45秒，35次循环，反应体系20微升；PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色，选出有强扩增带的引物便是有用引物；其对应的扩增带便是荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。同时选出每对引物最适宜的退火温度；核酸引物序列见表1表1荔枝特异性SSR标记(基因座)及其引物表 根据所述的无核荔枝嫁接砧木选择新技术；一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合，采用以下技术步骤获得一)、应用荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记对部分荔枝种质进行遗传多样性分析；首先用改良的CTAB法提取多个荔枝种质的基因组DNA，然后用筛选出来的荔枝特异性的简单序列重复(SSR)引物，对基因组DNA进行PCR扩增。采用以下反应程序94℃1分15秒、各引物最适宜的退火温度1分15秒，72℃45秒，35次循环，反应体系总体积为20微升；PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色；二)、数据分析1)、SSR标记分析及遗传多样性分析选择扩增条带清晰且有多态性的SSR标记进行数据统计，有带记为“1”，无带记为“0”；用MVSP 3.13f软件根据Nei&Li(1979)的方法计算各种质间的相似系数(Genetic Similarity) (Nxy是种质x和y共有的谱带数，Nx和Ny分别是种质x和种质y各自的谱带数)2)、聚类分析采用UPGMA(Unweighted pair-group method using anarithmetic average)法，应用MVSP 3.13f软件进行聚类分析；三)、根据数据分析结果，挑选亲缘关系近的荔枝种质作砧木进行无核荔枝的嫁接繁殖；通过实验验证最后确定无核荔枝与A13号为最优接穗/砧木组合；当A13号荔枝种质的果实成熟以后，采果将种子取出，用水浸泡一天一夜，当胚根突破种皮时，播于苗床，苗床要遮荫，第二年6月便可作砧木进行嫁接。本专利技术的优点及有益效果是应用开发的荔枝SSR标记对荔枝种质，包括无核荔枝、早熟荔枝、大果型荔枝的亲缘关系进行了分析，从中找到了适于无核荔枝进行嫁接繁殖的砧木。通过无核荔枝嫁接砧木选择新技术进行无核荔枝的嫁接繁殖，使无核荔枝的接穗嫁接亲和力好、繁殖形成同质的无性系，成活率高达95％。无核荔枝品种与妃子笑、糯米糍相比，它具有果大、早熟、种核退化、风味口感上佳等优点。具体实施例方式从以下实施例将进一步理解本专利技术1、材料来源以无核荔枝、A13号、无核丁香等32个海南特有的荔枝品种和白糖罂、妃子笑、黑叶等少数几个广东荔枝品种以及两个龙眼主栽品种——石硖、储良作为实验材料。2、方法(1)、分离SSR序列 1)用无核荔枝作材料，用选择性扩增微卫星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，SAM)法分离SAM片段，挑选100个SAM片段回收、克隆、测序，再用Sputnik软件对测序结果进行分析，获得SSR序列。结果分析几乎所有片段都含有SSR序列。其中，大部分测序片段含有二核苷酸CT/TC也就是AG/GA重复(这与SAM扩增时采用的SSR primer——PCT6相符)，且重复数多为6，这样的片段占了80.1％。也有重复数为7、8、9、11、12、13、16的CT/TC序列；最多的达到18个CT重复，除了二核苷酸重复之外，个别序列中还含有三核苷酸重本文档来自技高网...

【技术保护点】
无核荔枝嫁接砧木选择新技术，其特征在于：应用荔枝特异ＳＳＲ分子标记分析荔枝种质获得一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合；荔枝特异ＳＳＲ分子标记采用以下技术步骤获得：一）、任用一种荔枝品种为材料，采用选择性扩增微卫星（ＳｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＭｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ，简称ＳＡＭ）法结合数据库搜索法分离简单序列重复（ＳｉｍｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｐｅａｔ，简称ＳＳＲ）序列；二）、用ＳＳＲ的侧翼序列设计ＳＳＲ引物：采用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计特异引物；引物设计参数为：引物长度（１８－２４ｎｔ）、３’端稳定性（－５．５～－９．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、引物Ｔｍ值（５３－６０℃）、ＧＣ含量（４５～５５％）、引物ｒａｔｉｎｇ值＞９０；三）、筛选有用引物，获得荔枝特异性的简单序列重复（ＳＳＲ）标记。采用与步骤１相同的荔枝品种作材料，以其基因组ＤＮＡ为模板，更换不同的简单序列重复（ＳＳＲ）引物进行扩增；采用以下反应程序：９４℃１分１５秒、（５７℃或５５℃、５３℃、５１℃、４５℃）不同的退火温度１分１５秒、７２℃４５秒，３５次循环，反应体系２０微升；ＰＣＲ产物经５％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色，选出有强扩增带的引物便是有用引物；其对应的扩增带便是荔枝特异性的简单序列重复（ＳＳＲ）标记。同时选出每对引物最适宜的退火温度；核酸引物序列见表１：表１荔枝特异性ＳＳＲ标记（基因座）及其引物表＊＊＊。...

【技术特征摘要】
1.无核荔枝嫁接砧木选择新技术，其特征在于应用荔枝特异SSR分子标记分析荔枝种质获得一个嫁接效果好的无核荔枝砧穗组合；荔枝特异SSR分子标记采用以下技术步骤获得一)、任用一种荔枝品种为材料，采用选择性扩增微卫星(Selectively AmplifiedMicrosatellite，简称SAM)法结合数据库搜索法分离简单序列重复(SimpleSequence Repeat，简称SSR)序列；二)、用SSR的侧翼序列设计SSR引物采用Primer Premier 5.0软件设计特异引物；引物设计参数为引物长度(18-24nt)、3’端稳定性(-5.5～-9.0kcal/mol)、引物Tm值(53-60℃)、GC含量(45～55％)、引物rating值＞90；三)、筛选有用引物，获得荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。采用与步骤1相同的荔枝品种作材料，以其基因组DNA为模板，更换不同的简单序列重复(SSR)引物进行扩增；采用以下反应程序94℃1分15秒、(57℃或55℃、53℃、51℃、45℃)不同的退火温度1分15秒、72℃45秒，35次循环，反应体系20微升；PCR产物经5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色，选出有强扩增带的引物便是有用引物；其对应的扩增带便是荔枝特异性的简单序列重复(SSR)标记。同时选出每对引物最适宜的退火温度；核酸引物序列见表1表1 荔枝特异性SSR标记(基因座)及其引物表2.根据权利要求所述的无核荔枝嫁接砧木选择新技...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明芳，郑学勤，吴新荣，王高，罗振标，洪钢池，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南陆侨农牧开发有限公司，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]