一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向抑制维生素K依赖性γ‑谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学技术领域。本发明专利技术通过构建维生素K循环小分子抑制剂筛选体系，可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；进一步通过检测小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制作用，并用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，可以得到靶向抑制维生素K依赖性γ‑谷氨酰羧化酶(VKGC)的小分子化合物。采用该方法，本发明专利技术首次筛选到一个特异性抑制维生素K依赖性γ‑谷氨酰羧化酶的小分子化合物，该小分子可用于研究VKGC蛋白的生化特性，具有开发为灭鼠药和抗凝药物的潜在应用价值。

Screening method and application of a small molecular compound targeting to inhibit vitamin K-dependent \u03b3 - glutamyl carboxylase

【技术实现步骤摘要】
一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用
本专利技术涉及一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学

技术介绍
维生素K在血液正常凝固中发挥重要作用，主要用于防止新生婴儿出血疾病、预防内出血以及维生素K拮抗剂的解毒剂。维生素K通过调节一些凝血因子(如凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ)的翻译后修饰参与凝血(如图1所示)。维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基γ羧基化修饰是其发挥凝血功能的必要条件。维生素K在这一翻译后修饰过程中发挥核心作用，并以三种形式在体内循环，分别是维生素K环氧化物(KO)、维生素K(K)和二氢维生素K(KH2)。目前已知两个酶在维生素K循环中发挥作用。其中维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶(VKGC)利用KH2为辅因子，对维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基进行γ羧基化修饰，同时把KH2转化成KO。为了使VKGC的催化反应可以持续进行，KO必须被还原成KH2，而这一反应主要是由具有KO还原酶活性和K还原酶活性的维生素K环氧化物还原酶(VKOR)催化的。VKOR催化KO到K，以及K到KH2，使维生素K可以循环利用。研究表明，VKOR是临床抗凝血药物华法林(warfarin)的特异性作用靶点，华法林通过抑制VKOR的活性，使KO不能转化为K和KH2，从而阻断了维生素K循环，进而抑制凝血因子Gla结构域的谷氨酸残基的γ羧基化修饰，达到抗凝血的目的。此外，杀鼠药溴敌隆也是特异性靶向VKOR的抑制剂。维生素K循环的关键酶(VKOR和VKGC)是开发抗凝血药物(或杀鼠药)的重要靶点，然而目前还没有报道特异性靶向VKGC的小分子化合物及其筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法。同时，本专利技术还提供一种通过上述方法筛选出的小分子化合物作为制备靶向维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的抑制剂的应用。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，包括以下步骤：1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；2)筛选对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；3)筛选靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物。本专利技术通过构建维生素K循环小分子抑制剂筛选体系(即双报告基因细胞体系)，可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；进一步通过检测筛选出的小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制作用，可以筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；最后用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，可以得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶(VKGC)的小分子化合物。采用该方法，本专利技术首次筛选到一个特异性抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物，该小分子可用于研究VKGC蛋白的生化特性，具有开发为灭鼠药和抗凝药物的潜在应用价值，是开发灭鼠药和抗凝药物的先导化合物。步骤1)中，所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex(invitrogen)。步骤1)中，所述FIX-Gla-PC融合基因(人源F9和PROC基因的重组基因)编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。步骤1)中，所述报告基因为荧光素酶报告基因，如甲虫(萤火虫)荧光素酶报告基因。甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步优选的，步骤1)中，所述同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因(甲虫荧光素酶报告基因)的质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液的培养基为含双抗的完全培养基，双抗分别为青霉素和链霉素。含双抗的完全培养基的组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone)。步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1～20μmol/L；更优选为5μmol/L。步骤2)中，VKOR蛋白活性测定可采用传统的微粒体法(参见文献：Fasco,M.J.,Principe,L.M.,Walsh,W.a&Friedman,P.a.WarfarininhibitionofvitaminK2,3-epoxidereductaseinratlivermicrosomes.Biochemistry.22,5655–60(1983)；Rost,S.,Fregin,A.,Ivaskevicius,V.,Conzelmann,E.&Hortnagel,K.MutationsinVKORC1causewarfarinresistanceandmultiplecoagulationfactordeficiencytype2.Nature.427,537–541(2004).)。优选的，采用以下方法：将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；和/或者，将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性。上述方法的检测原理是利用产物KH2在250nm的激发光下可以产生荧光的特性，通过检测产物KH2的生成量来反映VKOR蛋白的活性，该方法可以用终点法测定荧光强度反映VKOR的活性，也可以实时检测荧光强度反映VKOR蛋白的活性。所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3，配制得到GSH浓度为60-160m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物/n将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；/n所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n2)筛选对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物/n对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；/n3)筛选靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物/n用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物
将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；
所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
2)筛选对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物
对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；
3)筛选靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物
用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物。


2.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex。


3.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述报告基因为甲虫荧光素酶报告基因，甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


5.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1～20μmol/L。


6.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤2)中，VKOR蛋白活性抑制测定的方法如下：
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈国民，刘红丽，刘浩，沈滟，曹青，高蒙，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41