一种基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法技术

本发明专利技术属于生物材料检测领域，具体涉及一种基于GC‑MS与酶化学法检测生物样品中尿素含量的方法。该方法包括如下步骤：（1）检测条件；（2）样品处理；（3）图谱分析；（4）标准工作曲线样品溶液的制备；（5）含量计算。本方法通过柱前衍生化气相色谱‑质谱联用法，能够有针对性的检测出生物样品中的尿素含量，该方法利用尿素酶能专一地分解尿素地特性，将尿素转化为氨，再利用七氟丁酰氯与之较为迅速、完全地反应，使不能被GC‑MS检测地尿素得以被检测与定量。该方法灵敏度较光谱法更高，线性关系较好。

A method for the determination of urea in biological samples based on the combination of GC-MS and enzyme chemistry

【技术实现步骤摘要】
一种基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法
本专利技术属于生物材料检测领域，具体涉及一种基于GC-MS与酶化学法检测生物样品中尿素含量的方法。
技术介绍
尿素别名碳酰二胺、碳酰胺、脲。是由碳、氮、氧和氢组成的有机化合物。其化学公式为CON2H4、CO(NH2)2或CN2H4O，国际非专利药品名称为Carbamide。外观是白色晶体或粉末。尿素在肝合成，是哺乳类动物排出的体内含氮代谢物。这代谢过程称为尿素循环。尿素是第一种以人工合成无机物质而得到的有机化合物。化学式：CO(NH2)2，分子质量60.06，无色或白色针状或棒状结晶体，工业或农业品为白色略带微红色固体颗粒，无臭无味。含氮量约为46.67％，密度1.335g/cm3。溶于水、醇，不溶于乙醚、氯仿，呈弱碱性。CASNo.：57-13-6，分子量：60.05；熔点：131-135℃；沸点：196.6，折射率：n20/D1.40；闪光点：72.7℃，密度：1.335；水溶性：1080g/L(20℃)。化学性质：可与酸作用生成盐。有水解作用。在高温下可进行缩合反应，生成缩二脲、缩三脲和三聚氰酸。尿素于1828年被德国人Wohler首次合成，并于20世纪50年代被广泛使用，作为反刍动物的非蛋白氮源。它为低毒物质，大鼠经口LD5015g/kg，小鼠经口LD50为11.5g/kg。反刍动物由于其独特的消化系统结构，使得它们能够利用尿素来合成蛋白质。在牛的瘤胃中存在着大量具有脲酶活性的微生物，当牛进食含有尿素的饲料时可以将尿素分解为氨，这些微生物能够通过氨化反应或转氨反应将氨与碳水化合物合成菌体蛋白(MCP)，随后MCP在牛的真胃和小肠消化吸收。虽然尿素为低毒物质，但正因牛瘤胃中微生物能够分解尿素产氨这个特性，不恰当的使用反而会造成牛中毒死亡。主要原因如下：尿素管理不当，造成尿素被牛偷食或误食；饲料中尿素含量过高或尿素与饲料未混合均匀；投喂含尿素的饲料时同时饲喂含尿素酶的大豆饼或蚕豆；牛在食用含有尿素的饲料后大量饮水。以上均能导致尿素迅速分解，产生大量氨，导致牛瘤胃中的微生物无法将氨全部利用，以至于氨经瘤胃壁吸收入血导致中毒。在司法鉴定工作中时常会遇到牛尿素中毒的案件，而以现有技术报道方法无法很好地解决这类问题。因此，研制开发一种可快速准确的检测生物样品中尿素的方法一直是亟待解决的新课题。
技术实现思路
尿素由于分子极性很大，且很难气化，无法直接利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测。鉴于现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种准确、简便的检测生物样品中尿素的方法，通过脲酶和衍生化试剂对尿素处理后，使用GC-MS来间接检测尿素的方法，能够有针对性的检测出生物样品中的尿素含量，可排除许多外界因素的干扰，提高了检测的灵敏度，同时大大简化了检测步骤，节省了时间和成本。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法，具体包括以下步骤。(1)检测条件。气质联用仪：采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)。色谱柱：HP-5MS毛细管柱，规格：30m×0.25mm，0.25μm。前进样口温度、EI离子源温度、四极杆温度和接口温度分别为280℃、150℃、230℃、280℃，质谱仪采用单离子检测扫描(SIM)模式，电子能量为70eV。载气为高纯氦气(99.999％)，流速为1.0ml/min，不分流进样1μL。升温程序：初始柱温60℃，保持1min，随后以20℃/min的升温速率升至280℃，保持11min。(2)样品处理。取2份待检血样或其他生物样本0.5mL分别置于10mL离心管中，加入200μg/mL内标10μL，加入PBS缓冲液1mL后再加入22U/mL尿素酶0.5mL，另一份添加0.5mLPBS缓冲液，密封后放入45℃水浴锅中温育30min。此时尿素可全部被尿素酶分解为氨，待样品冷却后，加入3mol/LNaOH溶液1mL，再加入50μL衍生化试剂七氟丁酰氯并在水浴锅中40℃水浴10min，以对氨和内标进行衍生化。水浴结束后加入2mL乙酸乙酯：正己烷＝9：1，随后在涡旋仪上震荡5min以萃取，8000rpm/min离心5min。取上层有机溶剂1mL，干燥氮气吹至近干后取1μL于GC-MS进样分析。(3)图谱分析。衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.0min，特征质量数为m/z214(分子离子峰)、m/z194、m/z166、m/z146、m/z100、m/z69和m/z44(基峰)。(4)标准工作曲线样品溶液的制备。尿素酶溶液配置：将尿素酶溶于PH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中，配置成22U/ml的尿素酶溶液(由于尿素酶的活性会随时间降低，尽量现用现配)。内标配置：取适量1，6-己二胺，用0.1mol/LHCL稀释至200μg/ml，4℃冷藏储存。尿素工作液配置：根据所需线性范围将尿素稀释成不同浓度尿素标准液，超声波清洗机超声除菌10min，-20℃冰冻储存。(5)含量计算。将步骤(4)中制成的标准工作曲线样品溶液按照步骤(2)中样品处理的方法进行处理后进样分析。选择检测m/z100的选择离子色谱图，以衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为纵坐标，以血中添加尿素的质量浓度为横坐标，计算回归方程，计算含量时，将待测样品中七氟丁酰胺的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。所述的生物样本为尿液、胃内容物或血浆样品。该方法的最低检出限以S/N＝3进行计算，对于血中尿素的最低检出限为0.05μg/ml，定量限为0.10μg/ml。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下。1、本专利技术提供的基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法检测原理为间接测定生物样品中的尿素。2、本专利技术提供的基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法采用的是衍生化后的质谱法，而非传统的光谱法。可将血液凝固状态、溶血、试剂干扰等一些外界影响因素有效降低。3、本专利技术提供的基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法所用到的试剂种类更少，操作简单快速。4、本专利技术提供的基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法可检测的生物材料包括尿液、胃内容物或血浆样品。5、本专利技术提供的基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法用GC-MS检测尿素的方法，该方法利用尿素酶能专一地分解尿素地特性，将尿素转化为氨，再利用七氟丁酰氯与之较为迅速、完全地反应，使不能被GC-MS检测地尿素得以被检测与定量。该方法灵敏度较光谱法更高，线性关系较好。附图说明图1是尿素酶分解尿素化学式。图2是衍氨与七氟丁酰氯衍生化反应(主反应)。图3是不同碱性体系对衍生化效果的影响。图4是不同温度对衍生化效果的影响。图5是不同反应时间对衍生化效果的影响。图6是尿素经气相色谱质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：/n检测条件：/n气质联用仪：采用气相色谱-质谱联用仪；/n色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30 m×0.25 mm，0.25 μm；/n前进样口温度、EI离子源温度、四极杆温度和接口温度分别为280°C、150°C、230°C、280°C，质谱仪采用单离子检测扫描模式，电子能量为70eV；/n载气为高纯氦气(99.999%)，流速为1.0 ml/min，不分流进样1μL；/n升温程序：初始柱温60℃，保持1min，随后以20℃/min的升温速率升至280℃，保持11min；/n（2）样品处理：/n取2份待检血样或其他生物样本0.5mL分别置于10mL离心管中，加入200μg/mL内标10μL，加入PBS缓冲液1mL后再加入22U/mL尿素酶0.5mL，另一份添加0.5mL PBS缓冲液，密封后放入45°C水浴锅中温育30min；待样品冷却后，加入3mol/L NaOH溶液1mL，再加入50μL衍生化试剂七氟丁酰氯并在水浴锅中40°C水浴10min，以对氨和内标进行衍生化；水浴结束后加入2mL乙酸乙酯：正己烷=9：1，随后在涡旋仪上震荡5min以萃取，8000rpm/min离心5min；/n取上层有机溶剂1mL，干燥氮气吹至近干后取1μL于GC-MS进样分析；/n(3) 图谱分析：/n衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.0min，特征质量数为m/z 213(分子离子峰)、m/z194、m/z 166、m/z 146、m/z 100、m/z 69和m/z 44(基峰)；/n（4）标准工作曲线样品溶液的制备：/n尿素酶溶液配置：将尿素酶溶于PH7.4 磷酸盐缓冲液PBS中，配置成22U/ml的尿素酶溶液，尽量现用现配；/n内标配置：取适量1，6-己二胺，用0.1mol/L HCL稀释至200μg/ml，4°C冷藏储存；/n尿素工作液配置：根据所需线性范围将尿素稀释成不同浓度尿素标准液，超声波清洗机超声除菌10min，-20°C冰冻储存；/n（5）含量计算：/n将步骤（4）中制成的标准工作曲线样品溶液按照步骤（2）中样品处理的方法进行处理后进样分析；选择检测m/z166的选择离子色谱图，以衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为纵坐标，以血中添加尿素的质量浓度为横坐标，计算回归方程，计算含量时，将待测样品中七氟丁酰胺的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于GC-MS与酶化学法结合测定生物样本中尿素含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
检测条件：
气质联用仪：采用气相色谱-质谱联用仪；
色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30m×0.25mm，0.25μm；
前进样口温度、EI离子源温度、四极杆温度和接口温度分别为280°C、150°C、230°C、280°C，质谱仪采用单离子检测扫描模式，电子能量为70eV；
载气为高纯氦气(99.999%)，流速为1.0ml/min，不分流进样1μL；
升温程序：初始柱温60℃，保持1min，随后以20℃/min的升温速率升至280℃，保持11min；
（2）样品处理：
取2份待检血样或其他生物样本0.5mL分别置于10mL离心管中，加入200μg/mL内标10μL，加入PBS缓冲液1mL后再加入22U/mL尿素酶0.5mL，另一份添加0.5mLPBS缓冲液，密封后放入45°C水浴锅中温育30min；待样品冷却后，加入3mol/LNaOH溶液1mL，再加入50μL衍生化试剂七氟丁酰氯并在水浴锅中40°C水浴10min，以对氨和内标进行衍生化；水浴结束后加入2mL乙酸乙酯：正己烷=9：1，随后在涡旋仪上震荡5min以萃取，8000rpm/min离心5min；
取上层有机溶剂1mL，干燥氮气吹至近干后取1μL于GC-MS进样分析；
(3)图谱分析：
衍生化产物七氟丁酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊亭，夏玮，高利娜，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21