一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法技术

本发明专利技术提供了一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，属于细胞生物学技术领域。本发明专利技术针对甘蔗染色体数目多、形态小、根尖制片难于获得理想分裂相中期细胞的问题，提供一种高效的甘蔗茎尖染色体制片方法，利用生长旺盛时期的甘蔗和甘蔗近缘种的茎尖分生区组织进行染色体制片，具有取材方便、分生区组织样本量大、分裂旺盛、中期细胞多和染色体结构清晰、分散的优点，公开了材料选取、预处理、固定、解离染色、制片和染色体形态显微观察的技术要点。该方法简便、结果准确可靠、重复性好、易于操作，实验周期短，提高了甘蔗染色体基因组分析的效率。本发明专利技术将对甘蔗染色体核型研究、种质资源分类鉴定及保护利用提供技术支持。

An efficient method for chromosome preparation of stem tip of sugarcane or sugarcane related species

【技术实现步骤摘要】
一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法
本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法。
技术介绍
甘蔗是世界上重要的糖料经济作物和能源植物，甘蔗属包含细茎野生种、大茎野生种、热带种、印度种、中国种和肉质花穗种(亦称食穗种)6个种，甘蔗亚族中的斑茅、滇蔗茅和河八王等均为甘蔗的近缘植物。现代甘蔗品种大多含甘蔗属中2～3种的亲缘，遗传基础较狭窄，种性退化严重，为了培育新的优良的甘蔗品种，育种家进行了种内、种间及属间的杂交利用。期望能把野生种及近缘植物的抗性基因导入到甘蔗中，从而丰富甘蔗的遗传基础。在甘蔗种质资源分类、外源染色体的鉴定、基因的染色体定位、亲缘关系鉴定和减数分裂机理等研究中，都涉及到染色体的研究。甘蔗染色体制片的准备，是开展甘蔗细胞遗传学、甘蔗分子细胞遗传学以及基于染色体等相关研究的基础。然而，甘蔗是最复杂的异多倍体植物，染色体数目多(范围64～128)，形态小，难于获得理想的分裂相中期细胞染色体玻片标本。目前，国内外主要采用甘蔗根尖分生区组织进行制片，但在实际操作过程中还存在以下一些问题：水培甘蔗根尖有粘稠的分泌物，影响染色体制片效果。桶栽或沙培根尖无粘稠分泌物影响，但采集时需清洗泥沙，操作较繁琐；甘蔗根细小，主根少须根多，分生区组织区域很小，一般要用1～2条根尖才能制备1个玻片标本；桶栽、沙培或水培甘蔗根尖受营养环境因素影响较大，根尖粗细、老嫩程度不一，分裂周期难于把握，1批根尖样品中往往仅有少数几条根尖处在有丝分裂时期；不能保证每张制片都能观察到分裂相中期细胞，需要重复采集根尖和重复制片观察，这导致工作量加大；试验和实验周期均较长，一般1个材料的染色体数目鉴定耗时约需1～2个星期。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，可以快速获得制片背景干净，染色体形态结构清晰，分散良好的分裂相中期细胞，便于染色体数目统计和核型分析。本专利技术提供了一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，包括以下步骤：1)采集生长旺盛的甘蔗或其近缘种的茎尖分生区组织切成0.3～0.5cm3的小块状，用预冷的ddH2O灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理5～24h，得到预处理材料；2)将所述预处理材料进行固定，固定条件为4℃，固定时间为2～3d，用ddH2O灭菌水清洗后，用解离液在50～65℃水浴条件下解离20～25min，得到解离材料；所述解离液为1mol/LHCl溶液和体积百分浓度45％乙酸水溶液等体积混合形成的混合液；3)将所述解离材料转移至载玻片上，去除表面水分后，用改良苯酚卡宝品红染色液染色，夹碎所述解离材料，去除组织残渣，盖上盖玻片，染色4～8min，去除所述盖玻片周围染色液，压片，制得染色体分散的玻片标本。优选的，步骤1)中所述茎尖分生区组织包括甘蔗茎尖基部分生区组织和/或包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织，所述包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织为距离茎尖往上3cm内的幼叶分生区组织。优选的，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时期包括在甘蔗拔节期、伸长时期或伸长后期。优选的，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时间为晴天的上午9:00～11:00。优选的，步骤2)中所述固定用固定液为卡诺固定液；所述卡诺固定液为无水乙醇和冰醋酸按照体积比为3：1的比例混合而成。优选的，步骤3)中所述压片的方法为用带有橡皮的铅笔的一端敲击所述盖玻片，使染色体分散，然后用大拇指压所述盖玻片，使细胞平整分散，染色体处在同一平面上。优选的，所述甘蔗的品种包括拔地拉、57NG208、闽糖70-611、RB72-454、F1崖城96-48或BC2云蔗07-86。优选的，所述甘蔗近缘种包括甘蔗野生种和甘蔗近缘属植物；所述甘蔗野生种包括割手密和大茎野生种；所述甘蔗近缘属植物包括斑茅、芒、滇蔗茅和河八王。本专利技术提供了所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法制备得到的甘蔗染色体分散的玻片标本，染色体形态结构清晰，分散不重叠的分裂相中期细胞，背景干净无杂质。本专利技术提供所述甘蔗或甘蔗近缘种染色体分散的玻片标本在甘蔗或甘蔗近缘种的染色体核型分析或种质资源分类鉴定及保护利用中的应用。本专利技术提供的高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，与现有技术相比，取得以下有益效果为：1)在材料选取中，选择生长旺盛时期甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织进行制片，具有分生区组织范围大，细胞分裂周期集中，单个茎尖可以批量制备染色体玻片标本30～50张，而且每张制片上都可以观察到较多的分裂中期细胞，一般10张制片之内可以观察到便于染色体数目鉴定和核型分析的细胞20个以上，与根尖需观察50～100张制片相比，节省了制片时间和显微观察时间。2)甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织样品具有方便采集的特点，甘蔗生长周期长(1～1.5年)，除苗期和分蘖期外，处在拔节、伸长时期及后期生长旺盛时期的甘蔗茎尖均适宜进行染色体玻片标本制备。一年约有7～8个月时间，可随时到田间采集甘蔗茎尖进行相关细胞学研究，与根尖和茎段萌动芽染色体制片技术相比，无需重复采样，避免了根尖重复采集清洗的繁琐步骤，减轻了工作量，提高了工作效率。3)使用4℃条件下预处理甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织，有利于同步积累分裂相中期细胞，通过压片观察，可以在短时间内获得染色体形态结构清晰，分散良好的分裂相中期细胞，便于观察，2天内可完成1个甘蔗种质材料的染色体数目鉴定，与根尖和茎段萌动芽需1～2周时间相比，缩短了实验周期，提高了甘蔗染色体基因组分析的效率。4)采用解离液进行解离20～25min，细胞易分散，染色体清晰、重叠少，解离时间过短(10～15min)细胞较难分散，染色体重叠较多，解离时间过长(30min及以上)，易造成细胞破碎，染色体丢失或重叠较多。5)染色时间控制在4～8min，能够保证整体染色程度适中，不会产生染色不到位或染色过度情况。本专利技术提供的方法简便、鉴定结果准确可靠、重复性好、稳定性好、易于操作。没有经过细胞学训练的人员采用本专利技术方法也可以制备出良好的甘蔗染色体制片。同时，本专利技术提供的方法同样适用于滴片法和涂片法。本专利技术制备的染色体玻片标本将对甘蔗染色体核型研究、种质资源分类及保护等提供技术支持，也为甘蔗近缘种或其它作物染色体数量及核型分析方面的研究提供帮助。附图说明图1为甘蔗茎尖染色体制片技术方法流程图；图2为甘蔗茎尖分生区组织样品图片；图3为甘蔗茎尖有丝分裂相中期细胞染色体的镜检图(放大400×，物镜40×，目镜10×)；图4为甘蔗茎尖有丝分裂相中期细胞染色体的镜检图(放大1000×，物镜100×，目镜10×)；图5为甘蔗根尖分生区组织样品图片；图6为甘蔗根尖分生区组织的染色体效果观察图；图7为甘蔗茎段萌动芽组织样品图片；图8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)采集生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织切成0.3～0.5cm

【技术特征摘要】
1.一种高效的甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织切成0.3～0.5cm3的小块状，用预冷的ddH2O灭菌水浸泡，在4℃条件下预处理5～24h，得到预处理材料；
2)将所述预处理材料进行固定，固定条件为4℃，固定时间为2～3d，用ddH2O灭菌水清洗后，用解离液在50～65℃水浴条件下解离20～25min，得到解离材料；
所述解离液为1mol/LHCl溶液和体积百分浓度45％乙酸水溶液等体积混合形成的混合液；
3)将所述解离材料转移至载玻片上，去除表面水分后，用改良苯酚卡宝品红染色液染色，夹碎所述解离材料，去除组织残渣，盖上盖玻片，染色4～8min，去除所述盖玻片周围染色液，压片，制得染色体分散的玻片标本。


2.根据权利要求1所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤1)中所述茎尖分生区组织包括甘蔗茎尖基部分生区组织和/或包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织，所述包裹茎尖的2～3层幼叶分生区组织为距离茎尖往上3cm内的幼叶分生区组织。


3.根据权利要求1所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组织的采集时期包括在甘蔗拔节期、伸长时期或伸长后期。


4.根据权利要求1～3任意一项所述甘蔗或甘蔗近缘种茎尖染色体制片方法，其特征在于，步骤1)中所述生长旺盛的甘蔗或甘蔗近缘种的茎尖分生区组...

【专利技术属性】
技术研发人员：林秀琴，陆鑫，蔡青，周加芳，毛钧，吴转娣，刘洪博，刘新龙，李旭娟，字秋艳，李纯佳，徐超华，孔春艳，
申请(专利权)人：云南省农业科学院甘蔗研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53