靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株。该sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的sgRNA能够精确指导Cas9蛋白靶向切割MC1R基因，采用该sgRNA构建获得的表达载体转录获得的mRNA电转细胞转化率高，极大提高了敲除MC1R基因的成功率，获得的A549细胞株能够稳定低表达黑素生成的相关蛋白，对于研究黑素生成及抑制相关多肽的筛选、以及黑色素生成及皮肤相关疾病治疗等有着十分重要的意义。

SgRNA targeting to knock out human MC1R gene and its cell line

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株，尤其是构建的人MC1R基因敲除的A549细胞株。
技术介绍
MC1R基因在哺乳动物中由extension位点编码，为G蛋白偶联受体-黑素皮质素受体(melanocortinreceptors，MCRs)家族成员之一，只有一个编码区，其编码的蛋白质有7个跨膜结构域，主要表达于动物的黑色素细胞，为G蛋白偶联受体中最小的一个。MC1R蛋白是美白通路上研究较为透彻，也比较重要的受体之一。它是控制动物黑色素合成的重要基因，在黑素细胞、肾上腺皮质等多种细胞，以及神经系统和免疫系统中表现出不同的功能。CRISPR-Cas9基因编辑技术作为第三代基因编辑技术，相对于前两代基因编辑技术具有构建系统简单、精准度高、成本低、并且能同时对多个位点进行定点编辑等优势，已成为目前研究的热点。它主要通过一段短的引导RNA(guideRNA)来识别特定的DNA序列，然后由其引导的Cas9蛋白定位到该特定的DNA序列上进行切割，从而起到基因编辑的作用。现有实验技术中，与CRISPR-Cas9系统最为相似的是siRNA靶向的基因沉默技术，其主要缺点是在RNA水平的干扰，效率低下，不适用于长期抑制研究。对于黑素生成研究尚无MC1R基因缺失细胞模型，因此建立一株MC1R基因缺失的细胞株，对于研究黑素生成及皮肤相关疾病治疗等有着十分重要的意义。
技术实现思路
基于现有技术存在的缺陷，本专利技术的第一目的在于提供一种用于靶向敲除人MC1R基因的sgRNA；本专利技术的第二目的在于提供一种用于靶向敲除人MC1R基因的gRNA表达载体；本专利技术的第三目的在于提供gRNA表达载体的构建方法；本专利技术的第四目的在于提供扩增上述sgRNA的引物；本专利技术的第五目的在于提供一种用于敲除人MC1R基因的试剂盒；本专利技术的第六目的在于提供一种CRISPR-Cas9系统；本专利技术的第七目的在于提供一种用于构建人MC1R基因敲除的细胞株的试剂盒；本专利技术的第八目的在于提供一种人MC1R基因敲除的细胞株的构建方法；本专利技术的第九目的在于提供一种人MC1R基因敲除的A549细胞株；本专利技术的第十目的在于提供上述人MC1R基因敲除的A549细胞株作为细胞模型在研究肤色调控机制、相关多肽筛选和相关皮肤疾病中的应用。本专利技术的目的通过以下技术手段得以实现：一方面，本专利技术提供一种用于靶向敲除人MC1R基因的sgRNA，其包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1和所述sgRNA2的核苷酸序列如下：a、sgRNA1：CTGAGGGCGGCCACATGCCGGGG(如SEQIDNO:1所示)b、sgRNA2：AGACGGAGTGTCCCAGGAGTGGG(如SEQIDNO:2所示)。本专利技术的上述sgRNA是专利技术人采用CRISPR在线设计工具(http：//crispr.mit.edu/)，输入MC1R基因序列(ID:4157)。由于MC1R仅有一个外显子，本专利技术的目的是尽可能敲除或敲低MC1R基因，使其表达量降低，从而使能与其结合的效应因子如a-MSH无法结合而阻断下游黑素生成通路，因此在设计生成的众多sgRNA序列中，除了考虑得分率高外，还需综合评估敲除或敲低位点能否破坏MC1R蛋白编码，确定a-MSH可能的结合位点是否包含在敲除序列中，同时评估脱靶风险，经过筛选最终获得了本专利技术上述两条sgRNA寡核苷酸序列。采用上述两条sgRNA能够精确指导Cas9蛋白靶向切割MC1R基因。另一方面，本专利技术还提供一种用于靶向敲除人MC1R基因的gRNA表达载体，该gRNA表达载体包括包含上述sgRNA1的DNA序列的gRNA表达载体和包含上述sgRNA2的DNA序列的gRNA表达载体。再一方面，本专利技术还提供上述gRNA表达载体的构建方法，其包括：分别扩增上述sgRNA1和sgRNA2、退火获得各自的双链DNA片段，通过DNA连接酶将各自的双链DNA片段分别连接到质粒载体上获得各自的gRNA表达载体。再一方面，本专利技术还提供一种扩增上述sgRNA的引物，其引物序列包括：扩增sgRNA1的引物序列：CRISPR-F1：5’-CACCGCTGAGGGCGGCCACATGCCGGGG-3’(SEQIDNO:3)CRISPR-R1：5’-CCCCCGGCATGTGGCCGCCCTCAGCAAA-3’(SEQIDNO:4)；扩增sgRNA2的引物序列：CRISPR-F2：5’-CACCGAGACGGAGTGTCCCAGGAGTGGG-3’(SEQIDNO:5)CRISPR-R2：5’-CCCCACTCCTGGGACACTCCGTCTCAAA-3’(SEQIDNO:6)。再一方面，本专利技术还提供一种用于敲除人MC1R基因的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物序列。再一方面，本专利技术还提供一种CRISPR-Cas9系统，该CRISPR-Cas9系统包括上述gRNA表达载体和Cas9质粒。再一方面，本专利技术还提供一种用于构建人MC1R基因敲除的细胞株的试剂盒，该试剂盒包括上述sgRNA1构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA和上述sgRNA2构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA。再一方面，本专利技术还提供一种人MC1R基因敲除的细胞株的构建方法，其包括如下步骤：将上述sgRNA1构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA、上述sgRNA2构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA和Cas9质粒体外转录的mRNA一并电转入宿主细胞中，然后进行单克隆培养并进行PCR鉴定；将PCR鉴定正确的阳性克隆进行扩增冻存，完成敲除细胞株的构建。上述的构建方法中，优选地，所述宿主细胞包括肿瘤细胞株。上述的构建方法中，优选地，所述肿瘤细胞株包括肺癌细胞株。上述的构建方法中，优选地，所述肺癌细胞株包括A549细胞株。上述的构建方法中，优选地，所述sgRNA1、所述sgRNA2分别构建的gRNA表达载体体外转录采用mMESSAGEmMACHINETMT7ULTRATranscriptionKit试剂盒。上述的构建方法中，优选地，所述Cas9质粒体外转录采用MEGAshortscriptTMT7TranscriptionKit试剂盒。上述的构建方法中，优选地，在进行电转入宿主细胞中时，所述sgRNA1构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA和所述sgRNA2构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA的总质量与Cas9质粒转录所得的mRNA质量比为1：(1～3)。上述的构建方法中，优选地，所述sgRNA1构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA和所述sgRNA2构建的gRNA表达载体体外转录的mRNA的质量比为1:1。再一方面，本专利技术还提供一种人MC1R基因敲除的A549细胞株。再一方面，本专利技术还提供上述人M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于靶向敲除人MC1R基因的sgRNA，其包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1和所述sgRNA2的核苷酸序列如下：/na、sgRNA1：CTGAGGGCGGCCACATGCCGGGG(SEQ ID NO:1)/nb、sgRNA2：AGACGGAGTGTCCCAGGAGTGGG(SEQ ID NO:2)。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于靶向敲除人MC1R基因的sgRNA，其包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1和所述sgRNA2的核苷酸序列如下：
a、sgRNA1：CTGAGGGCGGCCACATGCCGGGG(SEQIDNO:1)
b、sgRNA2：AGACGGAGTGTCCCAGGAGTGGG(SEQIDNO:2)。


2.一种用于靶向敲除人MC1R基因的gRNA表达载体，该gRNA表达载体包括包含权利要求1所述sgRNA1的DNA序列的gRNA表达载体和包含权利要求1所述sgRNA2的DNA序列的gRNA表达载体。


3.权利要求2所述gRNA表达载体的构建方法，其包括：分别扩增权利要求1所述sgRNA1和所述sgRNA2、退火获得各自的双链DNA片段，通过DNA连接酶将各自的双链DNA片段分别连接到质粒载体上获得各自的gRNA表达载体。


4.一种扩增权利要求1所述sgRNA的引物，其引物的序列包括：
扩增sgRNA1的引物序列：
CRISPR-F1：5’-CACCGCTGAGGGCGGCCACATGCCGGGG-3’(SEQIDNO:3)
CRISPR-R1：5’-CCCCCGGCATGTGGCCGCCCTCAGCAAA-3’(SEQIDNO:4)；
扩增sgRNA2的引物序列：
CRISPR-F2：5’-CACCGAGACGGAGTGTCCCAGGAGTGGG-3’(SEQIDNO:5)
CRISPR-R2：5’-CCCCACTCCTGGGACACTCCGTCTCAAA-3’(SEQIDNO:6)。


5.一种用于敲除人MC1R基因的试剂盒，该试剂盒包括权利要求4所述的引物。


6.一种CRISPR-Cas9系统，该CRISPR-Cas9系统包括权利要求2所述gRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁强，支旭勃，赵金礼，杨小琳，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61