一种融合抗菌蛋白的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供一种葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK与抗菌肽Mersacidin融合蛋白的制备与应用，表达该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术对该融合蛋白进行异源表达及纯化，检测发现该融合蛋白比较稳定，作用温度和pH均比较广，其对包括金黄色葡萄球菌在内的多种葡萄球菌均有特异的杀菌效果。本发明专利技术提供的抗葡萄球菌融合蛋白为食品，尤其是奶制品中的葡萄球菌的防治提供了提供一种安全的蛋白制剂来源，具有广泛的应用前景。

Preparation and application of a fusion antibacterial protein

【技术实现步骤摘要】
一种融合抗菌蛋白的制备及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK与抗菌肽Mersacidin融合蛋白的制备方法与应用。
技术介绍
葡萄球菌广泛分布于空气、地面、水体及畜禽饲料，为革兰氏阳性菌，呈圆形或卵圆形，直径约0.8μm，没有鞭毛，无荚膜，亦不能产生芽胞。少数葡萄球菌可导致人兽共患疾病，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)一直是医源性感染排名仅次于大肠杆菌的致病菌，可引起关节炎、骨髓炎、伤口感染、败血症和中毒性休克综合征等多种疾病。金黄色葡萄球菌可感染肉类、蛋类、奶类食品，引起人体食物中毒，也可感染畜禽甚至水产动物。目前，感染金黄色葡萄球菌后最普遍的治疗方式是口服或注射抗生素。然而，人类对抗生素的强烈依赖也造成了它的过度使用。近些年来，不断有关于“超级细菌”——多重耐药性细菌的报道，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐多药肺炎链球菌(MDRSP)、耐万古霉素肠球菌(VRE)等。因此，对新型非抗生素类抗菌剂的研发迫在眉睫。自1915年噬菌体发现以来，噬菌体已经成功应用于治疗痢疾、伤口感染等疾病。细菌耐药问题日趋严峻的现在，噬菌体用于新型抗菌剂的研发重新受到研究者的重视。然而，不可否认的是，噬菌体作为活体病毒，在动物体内可能遭受免疫系统攻击、且噬菌体还有可能带来未知的抗性基因，此外，细菌也可能会对噬菌体产生抗性。因此，应用噬菌体开发抗菌剂仍然存在问题。噬菌体裂解酶(bacteriophagelysins)是烈性噬菌体感染宿主细菌后晚期一类细胞壁蛋白水解酶，可水解宿主菌细胞壁的肽聚糖，引起细胞裂解。研究发现，噬菌体裂解酶可以从革兰氏阳性菌的外面破坏细胞壁，进而杀菌，且见效快、裂解谱广、安全性高。噬菌体裂解酶作用靶点肽聚糖为细菌非常保守的成分，所以细菌很难对噬菌体裂解酶产生抗性，此外，噬菌体裂解酶的应用还避免了噬菌体可能遭受动物体免疫系统攻击及带来抗性基因的风险。分子生物学的发展也为噬菌体裂解酶基因的重组表达奠定了坚实基础。作为抗菌药物的候选者，葡萄球菌噬菌体裂解酶如ClyS(DanielAetal.,AntimicrobialAgents&Chemotherapy,2010,54,4,1603-1612)、LysK(BeckerSCetal.,FEMSMicrobiolLett,2008,287,2,185-191)、SAL-2(SonJee-Sooetal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2010,86,1439-1449)等陆续被报道，它们显示出良好的抗金黄色葡萄球菌效果。噬菌体裂解酶在医药、食品保鲜、水产养殖等领域的应用前景十分光明，提高噬菌体裂解酶的抗菌效果势在必行。改善噬菌体裂解酶效果的策略之一是将它们与其他抗菌剂联合使用，发挥对病原菌感染的协同治疗作用。抗菌肽通常是由20-60个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，其具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，其杀菌速度优于普通噬菌体裂解酶。1992年，ChatterjeeS报道了Bacillusspp.产生的杆菌肽Mersacidin有效印制MRSA细胞壁合成酶的活性，通过腹腔给药可以清除MRSA感染小鼠血液、肺、肝、肾、脾等脏器中的细菌，并且对小鼠各器官没有造成明显的损害。然而，杆菌肽Mersacidin对在体内可能会对多种微生物进行无选择性的攻击，在杀灭致病菌的同时有可能会破坏正常菌群的平衡，因此会对动物体产生一定的风险。目前，将噬菌体裂解酶与抗菌肽相结合生产融合抗菌蛋白用于防治葡萄球菌感染的报道不多。中国专利CN201510844661.7公开了一种葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶，该裂解酶用于防治多种葡萄球菌，对葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染具有显著的防治效果，但该裂解酶对不同宿主菌的裂解作用不稳定，尤其是金黄色葡萄球菌。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种抗葡萄球菌的噬菌体裂解酶LysK与抗菌肽Mersacidin融合蛋白及其制备方法。该融合蛋白结合噬菌体裂解酶及抗菌肽的优点，可同时作用于葡萄球菌的细胞壁和细胞膜。该融合抗菌蛋白对多种葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌均有很强的杀伤作用，该融合抗菌蛋白对葡萄球菌引起的感染具有显著的防治效果，在医药、食品保鲜、水产养殖等领域都具有良好的应用前景。一方面，本专利技术提供了一种抗葡萄球菌融合蛋白。具体地，所述的抗葡萄球菌融合蛋白由基因工程改造的噬菌体裂解酶LysK与抗菌肽Mersacidin基因共同表达获得。具体地，所述的抗菌蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO:1，氨基酸序列如SEQIDNO:2。本专利技术还提供了包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的重组表达载体和包含所述重组表达载体的重组菌。另一方面，本专利技术提供了前述抗葡萄球菌融合蛋白的制备方法。具体地，所述的制备方法包括以下步骤：(1)人工合成SEQIDNO:1所示核苷酸序列；(2)将步骤(1)合成的序列连接到表达载体中，得到重组质粒；(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化宿主菌，得到重组大肠杆菌；(4)诱导重组菌表达抗葡萄球菌融合蛋白；(5)收集步骤(4)得到的菌体，破碎细胞并对上清液进行纯化；(6)将(7)纯化得到的蛋白进行去毒处理，即获得所述抗葡萄球菌融合蛋白。优选地，所述的步骤(2)中的表达载体为pET32a(+)表达载体。优选地，所述的步骤(2)中合成序列通过BamHI、XhoI酶切位点连接到表达载体。优选地，所述的步骤(3)的宿主菌为BL21(DE3)宿主菌。优选地，所述的步骤(4)诱导重组菌表达条件为0～1mmol/LIPTG，4-37℃诱导；进一步优选为4℃、16℃、25℃和37℃。优选地，所述的步骤(5)中破碎细胞采用超声破碎。优选地，所述的步骤(5)中对上清液进行纯化采用His亲和层析镍柱纯化。优选地，所述的步骤(6)中去毒处理采用去毒素试剂盒，如ThermoFisher公司去毒素试剂盒。再一方面，本专利技术提供了前述的抗葡萄球菌融合蛋白及其制备方法、重组表达载体、重组菌在防治葡萄球菌感染和污染中的应用。具体地，所述的应用为在预防、抑制或治疗葡萄球细菌感染中的应用。具体地，所述的应用包括但不限于在抑制食品中的金黄色葡萄球菌的应用。进一步具体地，所述的食品包括但不限于奶制品，小麦制品，玉米制品，大米制品。优选地，所述的抗葡萄球菌融合蛋白的应用温度为20-50℃，进一步优选为为35℃。又一方面，本专利技术提供了一种葡萄球菌抑制剂或其添加剂。具体地，所述的抑制剂或其添加剂包含前述的抗葡萄球菌融合蛋白。又一方面，本专利技术提供了一种针对葡萄球细菌感染的药物，其特征在于，所述的药物中包含前述的融合蛋白。具体地，所述的针对葡萄球细菌感染的药物包括预防、抑制和治疗葡萄球细菌感染的药物。附图说明...

【技术保护点】
1.一种抗葡萄球菌融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白自氨基端到羧基端依次含有葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK和抗菌肽Mersacidin的序列；所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗葡萄球菌融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白自氨基端到羧基端依次含有葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK和抗菌肽Mersacidin的序列；所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.一种编码权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包括SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。


4.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌包括权利要求3所述的重组表达载体。


5.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)人工合成SEQIDNO:1所示核苷酸序列；
(2)将步骤(1)合成的序列连接到表达载体中，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化宿主菌，得到重组大肠杆菌；
(4)诱导重组菌表达抗葡萄球菌融合蛋白；
(5)收集步骤(4)得到的菌体，破碎细胞并对...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏鑫，崔新，
申请(专利权)人：苏州十一方生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32