一种用于免疫细胞培养的添加剂、培养基及免疫细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种用于免疫细胞培养的添加剂，添加剂的具体组成为：4‑氨基‑3‑酰基‑2‑萘酚、丝素蛋白、大豆低聚肽、水龙骨多糖、枸杞多糖、黄芩甙、IL‑2、IL‑12、IL‑21、胰岛素、亚硒酸钠、丙戊酸。本发明专利技术添加剂中的4‑氨基‑3‑酰基‑2‑萘酚和细胞生长因子IL‑2、IL‑12、IL‑21一起诱导免疫细胞扩增，本发明专利技术添加剂中的龙骨多糖、枸杞多糖和黄芩甙复配使用，刺激免疫细胞，提高免疫细胞的兴奋度，可有效抑制细胞进入休眠，提高免疫细胞的活性，进而促进免疫细胞的扩增。本发明专利技术添加剂中的丝素蛋白和大豆低聚肽配合使用，调节细胞扩增过程中的渗透压，对细胞膜起保护作用，提高细胞的保水能力。本发明专利技术添加剂的原料间协同作用，提高免疫细胞的增值率和免疫活性。

A kind of additive, medium and culture method for immune cell culture

【技术实现步骤摘要】
一种用于免疫细胞培养的添加剂、培养基及免疫细胞的培养方法
本专利技术涉及免疫细胞领域，尤其涉及一种用于免疫细胞培养的添加剂、培养基及免疫细胞的培养方法。
技术介绍
哺乳动物的免疫系统包括多个独特的细胞，这些细胞起到防御细菌、病毒、毒素以及其他非-宿主物质入侵宿主的作用。对免疫系统的特异性起到主要作用的细胞类型称作淋巴球，淋巴球中具有B细胞、T细胞以及称作自然杀伤细胞的NK细胞。NK细胞自产生具备能够准确区分自身和外界的能力，及时找出非自身之物并去除，因此称作自然杀伤(NK)细胞。在免疫疗法中激活的免疫细胞中，NK细胞是作为一种特征性形态的大颗粒淋巴细胞，具有杀死被感染病毒、肿瘤细胞的能力突出且不杀死大部分正常细胞的特性，NK细胞与IL-2、IL-12、干扰素等细胞因子反应，由此提供效价、分泌性、增殖性机能。在人体中，NK细胞的表现型是CD16及CD56，由于细胞表面上没有T细胞受体复合物，CD16和CD56被用作NK细胞的标志物。但是，即使对于正常人而言，这样对杀伤癌细胞起到卓越作用的NK细胞仅占据外周血淋巴球的5～25％，对于癌症患者而言，该比率降低至不足5％，因此，若没有通过免疫疗法的额外扩增过程，则对癌细胞的杀伤作用受限。在培养免疫细胞时，培养基作为免疫细胞体外扩增的主要载体，直接关系着其体外诱导的结果，包括增殖数量、杀瘤效果等各种生物活性指标。在基础研究中，为了促进细胞生长，培养液中添加了动物源性血清等生物活性物质，但是动物性成分在免疫细胞的临床性应用显然是不被允许的，因为存在血清批次造成的质量不稳定以及动源性污染等问题而存在安全隐患，在血源性细胞的培养中可从自身血样中提取的小量血清即可满足，甚至可以无需添加血清。因而越来越多的技术人员致力于研究成分明确的不含动物血清的培养基，即无血清培养基，可排除动物源性污染和血清导致的不确定性。但是，现有的无血清培养基扩增免疫细胞普遍存在增殖率低，细胞活性差，杀瘤效果不理想等问题，获得大量体外培养的免疫细胞存在困难。因此，寻找一种可以提高免疫细胞增殖率及免疫活性的培养基是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种用于免疫细胞培养的添加剂，可以诱导免疫细胞增殖，提高免疫细胞的增值率和细胞的免疫活性。本专利技术的目的之二在于提供一种用于免疫细胞的培养基。本专利技术的目的之三在于提供一种免疫细胞的培养方法。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种用于免疫细胞培养的添加剂，所述添加剂的具体组成为：4-氨基-3-酰基-2-萘酚、丝素蛋白、大豆低聚肽、水龙骨多糖、枸杞多糖、黄芩甙、IL-2、IL-12、IL-18、胰岛素、亚硒酸钠、丙戊酸。进一步地，所述添加剂中各组分的添加浓度为：4-氨基-3-酰基-2-萘酚22-25μg/L、丝素蛋白10.5-14.8μg/L、大豆低聚肽18-21μg/L、水龙骨多糖30-35mg/L、枸杞多糖45-50mg/L、黄芩甙22-25mg/L、IL-2100-150μg/L、IL-1280-120μg/L、IL-215-50μg/L、胰岛素10-15mg/L、亚硒酸钠20-25mg/L、丙戊酸3-5ng/L。进一步地，所述添加剂中各组分的添加浓度为4-氨基-3-酰基-2-萘酚24μg/L、丝素蛋白12.5μg/L、大豆低聚肽19μg/L、水龙骨多糖33mg/L、枸杞多糖45mg/L、黄芩甙23mg/L、IL-2125μg/L、IL-12100μg/L、IL-2125μg/L、胰岛素12mg/L、亚硒酸钠22mg/L、丙戊酸4ng/L。进一步地，所述丝素蛋白的分子量为1474-1531Da，所述大豆低聚肽的平均分子量小于500Da。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种用于免疫细胞的培养基，包括基础培养基，所述基础培养基中添加上述的添加剂。进一步地，所述免疫细胞为NK细胞。进一步地，所述基础培养基为RPMI-1640。本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：一种免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)在基础培养基中加入上述的添加剂，制备得到培养基；(2)采集待培养的免疫细胞接种至上述步骤(1)的培养基中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种用于免疫细胞培养的添加剂，添加剂中的4-氨基-3-酰基-2-萘酚和细胞生长因子IL-2、IL-12、IL-21一起诱导免疫细胞扩增，本专利技术添加剂中的龙骨多糖、枸杞多糖和黄芩甙复配使用，刺激免疫细胞，提高免疫细胞的兴奋度，可有效抑制细胞进入休眠，提高免疫细胞的活性，进而促进免疫细胞的扩增。本专利技术添加剂中的丝素蛋白和大豆低聚肽配合使用，调节细胞扩增过程中的渗透压，对细胞膜起保护作用，提高细胞的保水能力。本专利技术添加剂的原料间协同作用，诱导免疫细胞增殖，缩短培养周期，提高免疫细胞的增值率和免疫活性。本专利技术还提供一种用于免疫细胞的培养基，通过在基础培养基中添加上述添加剂制备得到，及利用上述培养基培养免疫细胞的方法，该过程操作简便，便于免疫细胞体外的大量增殖，为免疫细胞更好的用于肿瘤治疗提供保障。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例1一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤:(1)在基础培养基RPMI-1640中加入添加剂，添加剂中各组分的添加浓度为：4-氨基-3-酰基-2-萘酚24μg/L、分子量为1531Da的丝素蛋白12.5μg/L、大豆低聚肽19μg/L、水龙骨多糖33mg/L、枸杞多糖45mg/L、黄芩甙23mg/L、IL-2125μg/L、IL-12100μg/L、IL-2125μg/L、胰岛素12mg/L、亚硒酸钠22mg/L、丙戊酸4ng/L；(2)取健康人外周血15mL转移至50mL的离心管中，离心后取血浆，加入生理盐1：1稀释，将稀释液平铺至淋巴细胞分离液上层，2000r/min离心15min，吸取白膜层，生理盐水洗涤三次，去除上清，将细胞用RPMI-1640培养基重悬，采用磁珠筛选，获得NK细胞，调整至细胞密度为1×106/mL，在T75细胞培养瓶中加入10mL上述步骤(1)的培养基，取2mL密度为1×106/mL的NK细胞接种于上述培养基中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养，每隔2天补液一次，培养12天。实施例2一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤:(1)在基础培养基RPMI-1640中加入添加剂，添加剂中各组分的添加浓度为：4-氨基-3-酰基-2-萘酚25μg/L、分子量为1474Da的丝素蛋白14μg/L、大豆低聚肽20μg/L、水龙骨多糖35mg/L、枸杞多糖45mg/L、黄芩甙22mg/L、IL-2130μg/L、IL-1280μg/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于免疫细胞培养的添加剂，其特征在于，所述添加剂的具体组成为：4-氨基-3-酰基-2-萘酚、丝素蛋白、大豆低聚肽、水龙骨多糖、枸杞多糖、黄芩甙、IL-2、IL-12、IL-18、胰岛素、亚硒酸钠、丙戊酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于免疫细胞培养的添加剂，其特征在于，所述添加剂的具体组成为：4-氨基-3-酰基-2-萘酚、丝素蛋白、大豆低聚肽、水龙骨多糖、枸杞多糖、黄芩甙、IL-2、IL-12、IL-18、胰岛素、亚硒酸钠、丙戊酸。


2.根据权利要求1所述用于免疫细胞培养的添加剂，其特征在于，所述添加剂中各组分的添加浓度为：4-氨基-3-酰基-2-萘酚22-25μg/L、丝素蛋白10.5-14.8μg/L、大豆低聚肽18-21μg/L、水龙骨多糖30-35mg/L、枸杞多糖45-50mg/L、黄芩甙22-25mg/L、IL-2100-150μg/L、IL-1280-120μg/L、IL-215-50μg/L、胰岛素10-15mg/L、亚硒酸钠20-25mg/L、丙戊酸3-5ng/L。


3.根据权利要求2所述用于免疫细胞培养的添加剂，其特征在于，所述添加剂中各组分的添加浓度为4-氨基-3-酰基-2-萘酚24μg/L、丝素蛋白12.5μg/L、大豆低聚肽19μg/L、水龙骨多糖33mg/L、枸杞多糖45mg/L、...

【专利技术属性】
技术研发人员：于继莲，王长继，
申请(专利权)人：于继莲，
类型：发明
国别省市：河南;41