抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段及其制备与应用制造技术

本发明专利技术提供一种抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段及其制备与应用，Fab片段包含重链，所述重链含有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的Fab片段纯化流程简洁，操作简单，高产出，制得的抗右旋氧氟沙星Fab片段用于Elisa检测时，灵敏度高。

Fab fragment of anti-d-ofloxacin antibody and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段及其制备与应用
本专利技术涉及食品安全检测
，特别是涉及一种抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段及其制备与应用。
技术介绍
氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones,FQs)，是临床上一类广谱抗生素。其中氧氟沙星(Ofloxacin，OFL)作为第三代氟喹诺酮类抗菌药，是水生环境中最常检测到的氟喹诺酮药物之一。为保障动物食品质量安全和公共卫生安全，农业部第2292号公告规定禁止在食品动物中使用氧氟沙星等4种兽药。氧氟沙星是一种手性药物，包括左旋氧氟沙星(S-Ofloxacin，S-OFL)和右旋氧氟沙星(R-Ofloxacin，R-OFL)两种旋光活性对映异构体，其中左旋氧氟沙星比右旋氧氟沙星抑菌效力高两个数量级。氧氟沙星对映体具有完全相同的化学组成以及极为相似的理化性质，但由于旋光性的不同，导致对映体之间具有明显不同的生物活性。因此，有必要研究其由于光学活性差异导致的生物活性差异的机制。基于抗原抗体的免疫分析方法，如酶联免疫检测方法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，可对小分子物质进行快速、高灵敏的检测筛查。利用手性分子可诱导产生具有对映选择性识别能力的抗体，在此基础上可实现手性小分子的特异性检测与分离，同时可开展手性分子与大分子抗体之间相互作用机制的研究。而在免疫分析方法中，经常会出现抗体的恒定区常与待测物发生非特异性相互作用的现象，而缺少恒定区的抗原结合片段(Antigen-bindingFragments，Fab)很好地规避了这一现象。同时，Fab片段由轻链和重链Fd片段(VH-CH1结构域)组成，完全保留了抗体的抗原结合部位，在免疫分析方法建立及活性机制研究中有广泛应用价值。目前制备天然抗体Fab片段的方法主要为酶解法，工艺简便，得率高。通过蛋白酶水解全抗IgG铰链区上方肽键，将IgG水解成抗原结合区Fab片段和恒定区Fc片段，随后对酶解产物进行纯化，得到较为纯净的目标Fab片段。纯化Fab片段通常是亲和层析法，常用的亲和配体有蛋白A、蛋白G以及蛋白L。蛋白L配体特异性结合Kappa型轻链抗体，但其结合部位尚不清楚；蛋白G配体结合部位较为广谱，对Fab及Fc都有结合，常用来进行抗体初步纯化；蛋白A特异性结合Fc片段，三种亲和配体各具特点，在实际纯化中需根据抗体的特性进行选择。仅依靠亲和层析纯化Fab片段较难达到理想的纯度，后续往往需要使用离子交换、疏水层析、凝胶过滤等手段进行两步甚至三步纯化，找到最优的组合纯化策略。纯化步骤的增加和策略不当会降低蛋白得率以及活性，所以，对Fab片段高效制备纯化策略进行研究具有重要意义。目前的研究大多都集中在左旋氧氟沙星或消旋氧氟沙星上，尚无针对右旋氧氟沙星抗体Fab片段的纯化方法报道，也没有基于Fab片段特异性检测右旋氧氟沙星的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术中的不足，提供一种蛋白酶酶解和两步纯化制备抗右旋氧氟沙星抗体Fab片段的方法。本专利技术运用一种木瓜蛋白酶酶解的策略和凝胶过滤层析与蛋白A亲和层析结合的两步纯化工艺，首次获得抗右旋氧氟沙星抗体Fab片段，采用本专利技术纯化工艺制备得到的抗体Fab片段同时具备高灵敏度的性能，为建立抗右旋氧氟沙星的免疫检测方法提供了核心原材料，具有广阔的发展前景。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供一种抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段，其包含重链，所述重链含有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列或与SEQIDNO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本文所用的术语“同源性”是指：经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80％同源性”是指同源性为80％至100％任一值，包括但不限于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等。可选地，其还包含轻链，所述轻链含有如SEQIDNO:1所示氨基酸序列或与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。可选地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素。可选地，所述喹诺酮类抗生素包括右旋氧氟沙星。本专利技术还提供一种抗体，其含有上述Fab片段，该抗体可以为单克隆抗体。优选地，所述抗体为单克隆抗体。本专利技术还提供核苷酸分子，其编码上述Fab片段。可选地，其重链含有如SEQIDNO:4所示核苷酸序列或与SEQIDNO:4具有至少80％同源性的核苷酸序列，或者所述重链的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。可选地，其轻链含有如SEQIDNO:3所示核苷酸序列或与SEQIDNO:3具有至少80％同源性的核苷酸序列，或者所述轻链的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供表达载体，其包含上述核苷酸分子。本专利技术还提供宿主细胞，其包含上述核苷酸分子或上述表达载体。本专利技术还提供上述Fab片段的制备方法，包括：提供抗右旋氧氟沙星抗体，采用蛋白酶酶解所述抗右旋氧氟沙星抗体，将所述酶解产物纯化，得到所述Fab片段。可选地，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶中的至少一种。可选地，纯化所述酶解产物时，纯化方法包括凝胶过滤层析、亲和层析。优选地，先进性凝胶过滤层析，再进行亲和层析。可选地，凝胶过滤层析时，采用的填料选自Superdex200、Superdex75中的任一种。可选地，亲和层析时，采用的蛋白选自蛋白A、蛋白L、蛋白G中的任一种。本专利技术还提供上述Fab片段在检测抗生素或解析蛋白质三维结构中的应用。可选地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素。可选地，所述喹诺酮类抗生素包括但不限于氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星等。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术运用一种木瓜蛋白酶酶解的策略和凝胶过滤层析与蛋白A亲和层析结合的两步纯化工艺，首次获得抗右旋氧氟沙星抗体Fab片段，采用本专利技术纯化工艺制备得到的抗体Fab片段同时具备高灵敏度的性能，为建立抗右旋氧氟沙星的免疫检测方法提供了核心原材料，具有广阔的发展前景。本专利技术的Fab片段纯化流程简洁，操作简单，高产出，制得的抗右旋氧氟沙星Fab片段用于ELISA检测时，灵敏度高。附图说明图1显示为实施例3的纯化色谱结果图。图2显示为实施例3的SDS-PAGE电泳图。图3显示为实施例4的亲和纯化色谱结果图。图4显示为实施例4的SDS-PAGE电泳图。图5显示为抗右旋氧氟沙星抗体Fab片段对右旋氧氟沙星的间接竞争ELISA标准曲线图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段，其特征在于：其包含重链，所述重链含有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段，其特征在于：其包含重链，所述重链含有如SEQIDNO:2所示氨基酸序列或与SEQIDNO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述重链的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的Fab片段，其特征在于：其还包含轻链，所述轻链含有如SEQIDNO:1所示氨基酸序列或与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1所述的Fab片段，其特征在于：所述抗生素包括喹诺酮类抗生素，优选地，所述喹诺酮类抗生素包括右旋氧氟沙星。


4.一种抗体，其含有权利要求1-3任意一项所述的Fab片段，优选地，所述抗体为单克隆抗体。


5.核苷酸分子，其编码权利要求1-3任意一项所述的Fab片段。


6.根据权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于：其含有编码所述Fab片段重链的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈兴，鲍虹蕾，雷红涛，甘庆庆，徐振林，杨金易，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44