一种广谱识别藻毒素纳米抗体及酶联免疫分析方法技术

本发明专利技术公开了一种广谱识别藻毒素的纳米抗体及酶联免疫分析方法。所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术利用此纳米抗体建立了广谱的检测藻毒素酶联免疫分析方法。本发明专利技术得到一种可以识别多种藻毒素药物的纳米抗体，且检测结果准确、效果好、稳定性好、广谱性好。该方法可以广泛的应用于饮用水中藻毒素的残留检测，避免了利用单克隆抗体和多克隆抗体建立免疫检测方法时候，目前单克隆抗体和多克隆抗体均表现稳定性差、易失活的缺点的不足，使酶联免疫分析检测法更具市场前景。本方法具有很大的应用推广价值。

A broad-spectrum recognition of microcystin nano antibody and enzyme-linked immunosorbent assay

【技术实现步骤摘要】
一种广谱识别藻毒素纳米抗体及酶联免疫分析方法
本专利技术涉及藻毒素类天然毒素的检测
，更具体地，涉及一种广谱识别藻毒素的纳米抗体及酶联免疫分析方法。
技术介绍
藻毒素是由天然水体中的蓝藻产生并释放到水体中的一种生物毒素，主要类别分为肝毒素、神经毒素、皮肤毒素以及脂多糖毒素四大类，其中肝毒素的毒性最强。肝毒素又包含微囊藻毒素(microcysin，MC)、节球藻毒素(nodularin，NOD)和柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，CYN)。世界卫生组织及我国新生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)限定饮用水中MC-LR限量均为1.0μg/L。人们在生产和生活中，会产生大量含有氮、磷化合物的废水，当排入水体中，在适宜的温度和光照条件下会使蓝藻水华大爆发，而在爆发过程中，蓝藻会向外释放一种次生代谢产物——藻毒素，从而抑制水体中其他生物的生长。由于水华爆发一般由一种或几种优势种类为主，多种蓝藻共同产生，所以在水体中能检测出一种或多种藻毒素。藻毒素中的一大类都具有肝细胞毒性，其易溶于水，加热煮沸也不能将毒性破坏，且自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能将其完全去除。以MC-LR为例，毒理学研究表明，腹腔注射小白鼠的LD50值一般在50～60μg/kg(体重)，因此MC-LR的毒性可与有机磷类相当。1975年，美国宾夕法尼亚小镇的饮用水爆发水华，生活用水被MCs污染，导致当地超过半数人患上急性肠胃炎。1996年，在巴西血液透析中心，因透析液被MCs污染，导致131个病人中，有116人出现视力模糊、恶心、呕吐等症状，并有50余人最终死亡。2007年，我国太湖发生了震惊全国的饮用水污染事件，大面积暴发的蓝藻水华导致无锡市饮用水遭受藻毒素污染。现如今，云南滇池、江苏太湖、安徽巢湖的蓝藻水华事件也时有报道。此外，长江、黄河、松花江中下游等主要河流以及鄱阳湖、武汉东湖、上海淀山湖等几大淡水湖泊、水库，因为氮磷等富营养化，也都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染，同时检测到了MCs的存在。对中国南北几个省市各水体进行监测，发现均有不同程度的MCs污染，其中以沟塘水、河水和水库水最为严重。因此，在日益严重的水污染环境下，对藻毒素的监测对饮用水安全将越来越重要。针对微囊藻毒素的检测方法多样，其主要包括高效液相色谱法(HPLC)、高相液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、酶联免疫分析法。仪器法虽然准确性高，但以其价格昂贵，检测成本高，且不便于移动，无法做到现场检测。而基于抗体建立免疫分析方法，具有快速、灵敏、简便，低成本等优点，但是如今市场上所用到的单克隆抗体和多克隆抗体均表现稳定性差、易失活的缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术单克隆抗体和多克隆抗体均表现稳定性差、易失活的缺点的不足，提供一种广谱识别藻毒素类药物的纳米抗体及酶联免疫分析方法。本专利技术的第一个目的是提供一种抗藻毒素的纳米抗体。本专利技术的第二个目的是提供一种抗藻毒素的纳米抗体的编码基因。本专利技术的第三个目的是提供一种重组载体。本专利技术的第四个目的是提供一种重组细胞。本专利技术的第五个目的是提供所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测藻毒素中的应用，或制备检测藻毒素的免疫试剂盒的应用。本专利技术的第六个目的是提供一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法。本专利技术的第七个目的是提供一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术首先构建了双峰驼来源的噬菌体展示纳米抗体文库，并从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选到一种针对藻毒素类天然生物毒素的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，编码该纳米抗体的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。因此本专利技术要求保护一种抗藻毒素的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。一种抗藻毒素的纳米抗体的编码基因，所述纳米抗体的核苷酸序列如如SEQIDNO：2所示。优选地，所述藻毒素为微囊藻毒素。一种重组载体，所述重组载体含有所述编码基因。一种重组细胞，所述重组细胞含有所述重组载体。所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测藻毒素中的应用，或制备检测藻毒素的免疫试剂盒的应用，也属于本专利技术的保护范围。本专利技术进一步要求保护一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法，使用所述纳米抗体进行酶联免疫检测。优选地，以偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素(MC-LR-OVA)为包被原，以所述纳米抗体为抗体，进行间接竞争酶联免疫分析。更优选地，包括以下步骤：S1.偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素包被酶标板；S2.将微囊藻毒素标准品或待测样品加入酶标板微孔中，然后加入权利要求1所述纳米抗体；S3.加入酶标记的二抗，孵育；S4.加入显色液，孵育；S5.加入终止液并测定；S6.以药物标准浓度的log10值为横坐标，以各标准品浓度的吸光值与零标准孔吸光值的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的吸光值来计算待测样品中的藻毒素的含量。本专利技术还要求保护一种间接竞争酶联免疫分析检测藻毒素的试剂盒，含有所述纳米抗体。优选的，还含有包被有偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素的酶标版。更优选地，还含有微囊藻毒素标准品、二抗、包被液、显色液、终止液、稀释液、洗液。更优选地，二抗为兔抗VHH-HRP多克隆抗体。更优选地，显色液为TMB。更优选地，终止液为H2SO4。更优选地，稀释液为PBSpH7.4。更优选地，洗液为PBST。最优选的，一种间接竞争酶联免疫分析检测藻毒素的试剂盒，含有所述纳米抗体、包被有偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素的酶标版、微囊藻毒素标准品、兔抗VHH-HRP多克隆抗体二抗、TMB显色液、H2SO4终止液、稀释液、PBST洗液。其使用方法为：将50μL所述纳米抗体加入到包被抗原孔内；将50μL梯度稀释的微囊藻毒素标准品和待测样本分别加入到包被抗原孔内，37℃反应40min；用300μLPBST洗板5次，加入5000倍稀释的兔抗VHH-HRP多克隆抗体二抗，37℃孵育反应40min；用300μLPBST洗板5次，然后加入100μL的TMB显色液，37℃孵育10min；最后加入50μL的10％H2SO4终止液，在OD450nm下读数。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术得到一种可以识别多种藻毒素的纳米抗体，且检测结果准确、效果好、稳定性好、广谱性好。该方法可以广泛的应用于饮用水中藻毒素的残留检测，避免了利用单克隆抗体和多克隆抗体建立免疫检测方法时候，目前单克隆抗体和多克隆抗体均表现稳定性差、易失活的缺点的不足，使酶联免疫分析检测法更具市场前景。本方法具有很大的应用推广价值。附图说明图1为ic本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗藻毒素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如如SEQ IDNO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗藻毒素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如如SEQIDNO：1所示。


2.一种抗藻毒素的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述纳米抗体的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述编码基因。


4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述重组载体。


5.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在检测藻毒素中的应用，或制备检测藻毒素的免疫试剂盒的应用。


6.一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法，其特征在于，使用权利要求1所述纳米抗体，进行酶联免疫检测。


7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，以偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弘，司睿，雷红涛，王锋，张玉琪，张瑾如，徐振林，肖治理，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44