一种脑组织甲基汞的活体检测方法技术

本发明专利技术涉及一种脑组织甲基汞的活体检测方法，包括如下步骤：(1)制备十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液：(2)采用静脉注射、腹腔注射或灌胃的方式将步骤(1)制备的50‑200μL的十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液注入活体体内；(3)在10min～6h之间，使用活体成像仪激发观察活体脑部荧光强度，活体成像仪的波长为400‑700nm；如果活体脑部没有荧光，则活体脑组织中含甲基汞；如果活体脑部有荧光，则活体脑组织中不含甲基汞。本发明专利技术利用金纳米簇可以生物成像的特性，以及十六聚体铁蛋白可穿越血脑屏障的特性，使其可以进入脑组织中进行生物医学成像，具有较高的稳定性和特异性，不需借助染料；十六聚体铁蛋白‑金纳米簇可应用于甲基汞中毒的生物体中脑组织的汞检测。

In vivo detection of methylmercury in brain tissue

【技术实现步骤摘要】
一种脑组织甲基汞的活体检测方法
本专利技术涉及一种脑组织甲基汞的活体检测方法，属于生物探针和生物成像标记物制备技术。
技术介绍
荧光金属纳米团簇是一类尺寸小于2nm的新兴荧光材料，它们具有出色的光稳定性和亚纳米尺寸的生物相容性，并且易于合成，受到广泛关注。利用这些特征，荧光金属纳米簇已经参与了荧光生物传感和生物成像等领域，并且在这些领域取得了很大的发展。蛋白质-金纳米簇复合物不仅提高了金纳米簇荧光的稳定性，同时借助于蛋白质自身的功能特性扩大了金纳米簇的应用范围。蛋白质-金纳米簇对汞离子、铅离子等重金属元素的检测是其最重要的性质之一，目前已有的研究中，蛋白质-金纳米簇能够在体外检测水溶液中的汞离子以及在体内检测腹部、胸部等器官中的汞离子，但是对脑组织中的汞离子不具备检测能力。蛋白质-金纳米簇能够实现对汞离子、铅离子等重金属元素的检测，是一种重要的生物探针，但是目前对脑组织中的汞离子、铅离子等重金属元素不具备检测能力。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种脑组织甲基汞的活体检测方法，利用金纳米簇可以在体内成像的特性，以十六聚体铁蛋白作为载体，使其借助脑神经细胞表面特异性受体穿越血脑屏障，进入脑组织中检测无机汞和甲基汞，而且不需借助染料，同时具有高特异性、高灵敏度和组织穿透力的特点。为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种脑组织甲基汞的活体检测方法，包括如下步骤：(1)制备十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液：a)分离纯化十六聚体铁蛋白，通过透析除盐，制备浓度为40mg/mL～60mg/mL的十六聚体铁蛋白溶液，并在35-40℃预热5～10分钟；b)制备浓度为3～10mM氯金酸溶液，调节pH至6.5-8.0，并在35-40℃预热5～10分钟；c)配制浓度为1M氢氧化钠溶液和盐酸溶液；d)将步骤a制备的十六聚体铁蛋白溶液和步骤b制备的氯金酸溶液混合均匀，十六聚体铁蛋白溶液与氯金酸溶液的体积比为2:1～1:2，并用步骤c制备的1M氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值大于等于10；e)静置反应，反应时间为4～24h，反应温度为25℃～40℃，反应结束后用步骤c制备的1M盐酸溶液将混合溶液pH值调至中性，获得浓度为50-100μM十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液；(2)采用静脉注射、腹腔注射或灌胃的方式将步骤1制备的50-200μL的十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液注入活体体内；(3)在10min～6h之间，使用活体成像仪激发观察活体脑部荧光强度，活体成像仪的波长为400-700nm；如果活体脑部没有荧光，则活体脑组织中含甲基汞；如果活体脑部有荧光，则活体脑组织中不含甲基汞。所述步骤1制备的十六聚体铁蛋白-金纳米簇溶液在紫外灯照射下有粉红色荧光。所述步骤1制备的十六聚体铁蛋白-金纳米簇溶液采用荧光分光光度计扫描，以480-540nm激发，在610-660nm处有最大发射峰。所述步骤3中，活体成像仪的波长为535nm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用金纳米簇可以生物成像的特性，以及十六聚体铁蛋白可穿越血脑屏障的特性，使其可以进入脑组织中进行生物医学成像，具有较高的稳定性和特异性，不需借助染料。此外，十六聚体铁蛋白-金纳米簇可应用于甲基汞中毒的生物体(人体、老鼠)中脑组织的汞检测。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行进一步说明。一种脑组织甲基汞的活体检测方法，包括如下步骤：(1)制备十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液：a)分离纯化十六聚体铁蛋白，通过透析除盐，制备浓度为40mg/mL～60mg/mL的十六聚体铁蛋白溶液，并在35-40℃预热5～10分钟；b)制备浓度为3～10mM氯金酸溶液，调节pH至6.5-8.0，并在35-40℃预热5～10分钟；c)配制浓度为1M氢氧化钠溶液和盐酸溶液；d)将步骤a制备的十六聚体铁蛋白溶液和步骤b制备的氯金酸溶液混合均匀，十六聚体铁蛋白溶液与氯金酸溶液的体积比为2:1～1:2，并用步骤c制备的1M氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值大于等于10；e)静置反应，反应时间为4～24h，反应温度为25℃～40℃，反应结束后用步骤c制备的1M盐酸溶液将混合溶液pH值调至中性，获得浓度为50-100μM十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液。(2)采用静脉注射、腹腔注射或灌胃的方式将步骤(1)制备的50-200μL的十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液注入活体体内；(3)在10min～6h之间，使用活体成像仪激发观察活体脑部荧光强度，活体成像仪的波长为400-700nm；如果活体脑部没有荧光，则活体脑组织中含甲基汞；如果活体脑部有荧光，则活体脑组织中不含甲基汞。所述步骤1制备的十六聚体铁蛋白-金纳米簇溶液在紫外灯照射下有粉红色荧光。采用荧光分光光度计扫描，以480-540nm激发，在610-660nm处有最大发射峰。实施例十六聚体铁蛋白-金纳米簇制备制备40mg/ml的十六聚体铁蛋白溶液，并在35℃预热10分钟，将其与pH为7，并在40℃预热5分钟的5mM的氯金酸溶液等比例混合，在磁力搅拌器上60r/min搅拌5分钟混合均匀，并将pH值调至11.5；然后放置于35℃反应6h，将pH值调至中性；在紫外灯下观察可见粉红色荧光。血脑屏障体外细胞模型成像体外培养神经内皮细胞bEnd.3，接种量3×105，在37℃5％的二氧化碳培养箱中培养24h。当覆盖率达到90％时，将细胞饥饿1h后，在培养液中加入终浓度1μM-20μM的十六聚体铁蛋白–金纳米簇，反应1h-4h后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲溶液洗三次。细胞用4％多聚甲醛在室温固定20-60分钟。用激光共聚焦显微镜观察。结果可以看出当用480-540nm波长激发时，细胞发出绿色的荧光。作为汞离子探针检测活体脑组织中甲基汞的存在维通利华裸鼠4周龄，以10mg/kg的剂量腹腔注射甲基汞，0.5-4小时后，通过尾静脉注射、腹腔注射、灌胃的方式将十六聚体铁蛋白-金纳米簇溶液(50μM，200μL)注入小鼠体内，4h后用小鼠活体成像仪535nm激发观察小鼠脑部荧光强度，以腹腔注射磷酸盐缓冲溶液的小鼠做对照。研究结果发现，注射甲基汞的小鼠脑部没有荧光与空白小鼠一样，而磷酸盐缓冲溶液组有荧光。甲基汞检测以小鼠急性甲基汞中毒模型为例，采用尾静脉注射的方式将50μM，200μL的十六聚体铁蛋白-金纳米簇溶液注射进入小鼠体内，经过4h后观察，可见小鼠脑部荧光发生淬灭。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脑组织甲基汞的活体检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/n(1)制备十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液：/na)分离纯化十六聚体铁蛋白，通过透析除盐，制备浓度为40mg/mL～60mg/mL的十六聚体铁蛋白溶液，并在35-40℃预热5～10分钟；/nb)制备浓度为3～10mM氯金酸溶液，调节pH至6.5-8.0，并在35-40℃预热5～10分钟；/nc)配制浓度为1M氢氧化钠溶液和盐酸溶液；/nd)将步骤a制备的十六聚体铁蛋白溶液和步骤b制备的氯金酸溶液混合均匀，十六聚体铁蛋白溶液与氯金酸溶液的体积比为2:1～1:2，并用步骤c制备的1M氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值大于等于10；/ne)静置反应，反应时间为4～24h，反应温度为25℃～40℃，反应结束后用步骤c制备的1M盐酸溶液将混合溶液pH值调至中性，获得浓度为50-100μM十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液；/n(2)采用静脉注射、腹腔注射或灌胃的方式将步骤1制备的50-200μL的十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液注入活体体内；/n(3)在10min～6h之间，使用活体成像仪激发观察活体脑部荧光强度，活体成像仪的波长为400-700nm；如果活体脑部没有荧光，则活体脑组织中含甲基汞；如果活体脑部有荧光，则活体脑组织中不含甲基汞。/n...

【技术特征摘要】
1.一种脑组织甲基汞的活体检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)制备十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液：
a)分离纯化十六聚体铁蛋白，通过透析除盐，制备浓度为40mg/mL～60mg/mL的十六聚体铁蛋白溶液，并在35-40℃预热5～10分钟；
b)制备浓度为3～10mM氯金酸溶液，调节pH至6.5-8.0，并在35-40℃预热5～10分钟；
c)配制浓度为1M氢氧化钠溶液和盐酸溶液；
d)将步骤a制备的十六聚体铁蛋白溶液和步骤b制备的氯金酸溶液混合均匀，十六聚体铁蛋白溶液与氯金酸溶液的体积比为2:1～1:2，并用步骤c制备的1M氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值大于等于10；
e)静置反应，反应时间为4～24h，反应温度为25℃～40℃，反应结束后用步骤c制备的1M盐酸溶液将混合溶液pH值调至中性，获得浓度为50-100μM十六聚体铁蛋白–金纳米簇溶液；
(2)采...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广华，吕晨艳，臧佳辰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11