一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法。所述多肽探针包括靶向多肽序列和修饰所述靶向多肽N端的发光物质X，所述靶向多肽序列包含(Hyp‑Hyp‑Gly)n。本发明专利技术设计的一种新型多肽探针，对变性的胶原蛋白具有良好的结合能力、生物相容性好、特异性强，而且合成工艺简单，操作流程方便。该探针为癌症、心血管疾病和器官纤维化等重要疾病的分子水平的诊断，提供了一种新的有潜力的检测方法。

A peptide probe and its detection method for target recognition of denatured collagen

【技术实现步骤摘要】
一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法
本专利技术涉及一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，属于生物检测

技术介绍
胶原蛋白是人体内含量最高的蛋白质，是细胞外基质的主要成分，它形成的分子支架，为皮肤、骨骼、肌腱等结缔组织提供结构完整性和机械强度。胶原蛋白具有非常特别的氨基酸序列，它要求每三个氨基酸中必须有一个甘氨酸，形成Gly-X-Y的特征性的重复序列。正常结缔组织的胶原蛋白呈现独特的三重螺旋结构，三条肽链由于链间氢键的相互作用精密堆积在一起。在肿瘤、关节炎等众多病理条件下，胶原蛋白分子的三重螺旋结构会被蛋白酶破坏，生成部分解折叠结构的变性胶原，影响胶原蛋白的正常生理功能。因此，变性胶原蛋白是众多重要疾病的关键生物标记物，建立变性胶原蛋白的高效检测方法，对这些疾病的病理机制的解析和准确诊断至关重要。目前胶原蛋白的检测方法主要是组织染色法，包括HE染色法、V.G染色法和Masson染色法等。其它的方法包括胶原蛋白抗体，衍生自胶原结合蛋白的肽，以及选自噬菌体表达的肽。这些方法存在操作复杂、探针结合能力弱、特异性不佳等缺陷，同时，它们通常是对所有胶原蛋白的同时检测，包括具有三重螺旋结构的天然胶原和变性胶原。只有变性的胶原蛋白才是导致胶原相关疾病的关键因素，因此，亟需建立针对变性胶原蛋白的高特异性的检测方法。设计合成一种对变性胶原蛋白具有特异性结合能力的新型多肽探针，对癌症、心血管疾病和器官纤维化等众多疾病的检测与疗效评价具有重要意义。其中，由GPO(Gly-Pro-Hyp)重复序列组成的天然氨基酸多肽，可特异性结合病变胶原蛋白。例如，中国专利CN107266562A公开了一种识别病变胶原蛋白的多肽探针，该探针在GPO的重复序列上修饰荧光物质，在常温条件下容易形成三重螺旋结构。但是，目前特异性结合病变胶原蛋白的多肽探针种类较少。因此，研究制备一种新的识别病变胶原蛋白的多肽探针，可以为胶原蛋白的特异性检测提供更多的选择。研究发现，羟脯氨酸(Hyp)对于形成健全的胶原蛋白特征序列Gly-X-Y至关重要，其中脯氨酸羟基化导致4R-羟基-L-脯氨酸(HypR)选择性地在胶原蛋白特征序列Gly-X-Y的Y位置发生，作为翻译后修饰，赋予了胶原蛋白特征序列Gly-X-Y额外的稳定性；而且单独地使4R构型的羟脯氨酸有利于形成由水介导的氢键，从而有利于折叠成三重螺旋结构。但是，在胶原蛋白特征序列Gly-X-Y中，Hyp的设置一般存在如下问题：①由于Hyp除了具有Pro的吡咯环以外也具有一个羟基，所以在合成的时候首先由于空间位阻的存在，并不容易合成；②在X位置，带有Cγ-endo的Pro残基通常稳定三螺旋，而带有Cγ-exo折叠的Pro残基使三螺旋不稳定，而Hyp偏爱Cγ-exo环褶皱，因此会过分增大胶原三螺旋的X位置的扭转角，不利于三螺旋结构的形成；③GOO(Gly-Hyp-Hyp)序列在Ⅰ型胶原蛋白链中几乎不存在，不属于天然胶原蛋白的组成序列，本领域技术人员一般会选择天然氨基酸序列做探针，而不会选择非天然的序列来进行探针的设计。本专利技术采用了非天然氨基酸序列GOO，通过固相合成的方法合成了具有GOO重复序列的胶原蛋白质模拟肽。获得的GOO重复序列不仅具有良好的折叠成三股螺旋的能力，而且能够与病变胶原蛋白解链位点进行杂交，能够作为一种新的胶原蛋白杂交肽对病变胶原蛋白进行靶向成像与检测。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供了一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法。本方法利用富含(Hyp-Hyp-Gly)n重复氨基酸序列的多肽对变性的胶原蛋白具有良好的结合能力，设计的一种新型多肽探针，生物相容性好、特异性强、合成工艺简单、检测方便。该探针为癌症、心血管疾病和器官纤维化等重要疾病的分子水平的诊断，提供了一种新的有潜力的检测方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针，所述多肽探针包括靶向多肽序列和修饰所述靶向多肽N端的发光物质X，所述靶向多肽序列包含(Hyp-Hyp-Gly)n。优选地，所述X为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料中的一种或几种。优选地，所述X为羧基荧光素FAM.优选的，所述多肽探针的序列为X-(Gly)m-(Hyp-Hyp-Gly)n，m为0-8之间的整数，n为4-20之间的整数。优选地，所述m为1，所述n为8-10之间的整数。优选地，所述n为8。优选地，所述n为10。一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针的制备方法，包括以下步骤：固相合成靶向多肽序列，再将发光物质修饰到该靶向多肽序列的N端。优选地，所述固相合成靶向多肽序列的方法为：a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的多肽。显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次；f)称取发光物质(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(4-10eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:水的体积比为95:5，反应1-6hrs；h)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针在制备成像试剂中的应用。优选地，所述成像试剂包括体外组织成像试剂和体内成像试剂。一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针在体外检测病变胶原蛋含量中的应用。优选的，所述检测方法为：在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μLDAPI稀释液染色0.5-1.5min，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)多肽探针的设计/n新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列中间含有较多的(Hyp-Hyp-Gly)n重复序列；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；/n(2)多肽探针的制备/n固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；/n(3)体外组织成像/n在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；/n(4)体内成像/n将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。/n

【技术特征摘要】
20190311 CN 20191017934271.一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)多肽探针的设计
新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列中间含有较多的(Hyp-Hyp-Gly)n重复序列；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；
(2)多肽探针的制备
固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；
(3)体外组织成像
在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1xPBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；
(4)体内成像
将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。


2.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述多肽探针的序列为X-(Gly)m-(Hyp-Hyp-Gly)n(m为0-8之，的整数，n为4-20之间的整数)；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Hyp为羟脯氨酸。


3.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述发光物质为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料中的一种或几种。所述发光物质连接在胶原多肽的N端。


4.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中多肽固相合成的具体方法为：
a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建喜，魏文宇，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62