特立帕肽的肽图检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特立帕肽的肽图检测方法。该肽图检测方法包括采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解，以RP‑HPLC法对酶解的肽段进行分析，酶解具体包括：1)空白样品制备：取碳酸氢铵溶液，加入胰蛋白酶溶液，置37℃水浴13‑15h，取出后终止反应，离心，收集上清液；2)供试品制备：取样品加入碳酸氢铵溶液，加入胰蛋白酶溶液，置37℃水浴13‑15h，取出后终止反应，离心，收集上清液；3)理化对照品制备：用超纯水稀释，取150μl，加入1％碳酸氢铵溶液350μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13‑15h，取出后终止反应，离心，收集上清液。应用本发明专利技术的技术方案，具有更好的分离效果。

Determination of trypatide by peptide map

【技术实现步骤摘要】
特立帕肽的肽图检测方法
本专利技术涉及生物医学
，具体而言，涉及一种特立帕肽的肽图检测方法。
技术介绍
DNA重组技术获得目的蛋白为现今最为常用的技术手段，中国基于此项技术的发展，在《中国药典》中起草人用重组DNA蛋白制品的总论，目的是规范生产和质量控制的要求。根据《中国药典》2015版三部“人用重组DNA蛋白制品总论”对于产品质量控制的要求，应进行制品的结构分析，以确认产品的正确性。蛋白一级结构分析通常采用胰蛋白酶或化学物质裂解蛋白后，采用适宜的分析方法进行一级结构完整性和准确性分析，称之为肽图检查。《中国药典》2015版四部中收录两种肽图检查方法，其中胰蛋白酶酶解-反相高效液相色谱肽图分析技术作为肽图检查第一法，其灵敏高，能够比较重组与天然蛋白质结构之间的差别，还可有效判别样品的变化的特点，使其成为基因工程药物的分子结构和遗传稳定性验证的首选方法。特立帕肽又名重组人甲状旁腺激素(1-34)等，能够刺激骨形成和骨吸收，可减少绝经后妇女骨折的发生率，根据给药方式的不同，还能提高或降低骨密度。连续输注可导致甲状旁腺素PTH浓度持续增高，比仅引起血清甲状旁腺素PTH浓度短暂增高的每日注射法产生的骨吸收作用更强。因此，特立帕肽的肽图检测十分重要。目前欧洲药典中现有的特立帕肽肽图检验方法以重组V8酶(水解Asp、Glu)在一定条件下水解特立帕肽，以反相高效液相色谱法进行肽图的检验，由于V8酶切位点的限制，仅能酶切5个片段，由于酶切片段较大，且第一个酶切片段较小，在后续的肽段覆盖率的检测中影响覆盖率检测。中国药典中采用肽段内切酶-胰蛋白酶酶解反相液相色谱法进行肽段分析，方法时间75分钟、柱温30℃±5℃，方法耗时较长，在对特立帕肽酶解肽段进行分析时出现个别肽段分离效果不佳的情况，分离度无法计算。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种特立帕肽的肽图检测方法，以提高特立帕肽的肽图检测准确性。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种特立帕肽的肽图检测方法。该肽图检测方法包括采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析，采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解具体包括：1)空白样品制备：取1％碳酸氢铵溶液500μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用；2)供试品制备：将样品用超纯水稀释到1.0mg/ml，取样品150μl，加入1％碳酸氢铵溶液350μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用；3)理化对照品制备：将理化对照品用超纯水稀释到1.0mg/ml，取对照品150μl，加入1％碳酸氢铵溶液350μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中所用的流动相A由0.1％三氟乙酸，10％乙腈和余量水组成，流动相A的各组分混匀后，超声脱气30min，备用，临用现配。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中所用的流动相B由0.1％三氟乙酸，10％水和余量乙腈组成，流动相B的各组分混匀后，超声脱气30min，备用，临用现配。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中所用的色谱柱为SymmetryC18色谱柱，3.9mm×150mm，5μm。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中检测波长为214nm；流速为1.0ml/min；进样量为100μl；柱温为20～25℃，样品室温度为10℃。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中采集时间为30min；积分条件为峰宽30，阈值50，最小面积20000，最小高度2000。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中梯度洗脱条件如下表(同表9)所示：时间流动相流动相A比例(％)流动相B比例(％)曲线101.01000--2301.0406063351.001006。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中高效液相色谱仪采用Waterse2695或Agilent1260高效液相色谱仪。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中仪器设置如下：按照Waterse2695或Agilent1260高效液相色谱仪标准操作规程准备仪器，根据色谱条件建立方法，用流动相A以低流速逐渐升至1.0ml/min平衡色谱柱约30min，待仪器平衡后，开始进样操作。进一步地，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中样品检测包括：基线平稳后，用移液器分别移取空白溶液、理化对照品溶液和供试品溶液各150μl至洁净干燥的内衬管中进样检测，每个样品进样一次，每次进样后平衡5min。应用本专利技术的技术方案，采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析，能够酶切10个片段，且片段均较大，能够容易进行肽段覆盖率的检测，且酶使用量更少。进一步的，该反相方法较现有胰蛋白酶解-反相液相色谱法通过调整色谱流动相的比例和洗脱梯度，检测时长缩短40分钟，调整柱温范围20～25℃，较原30℃±5℃液相分离方法具有更好的分离效果。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了对比例1中空白对照肽图谱图；图2示出了对比例1中理化对照品肽图谱图；图3示出了对比例2中空白对照肽图谱图；图4示出了对比例2中理化对照品肽图谱图图5示出了实施例1中空白对照肽图谱图；图6示出了实施例2中理化对照品肽图谱图(酶切时间15h)；以及图7示出了实施例3中理化对照品肽图谱图(酶切时间13h)。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种特立帕肽的肽图检测方法。该特立帕肽的肽图检测方法包括采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析，采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解具体包括：1)空白样品制备：取1％碳酸氢铵溶液500μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用；2)供试品制备：将样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特立帕肽的肽图检测方法，包括采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析，其特征在于，所述采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解具体包括：/n1)空白样品制备：取1％碳酸氢铵溶液500μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用；/n2)供试品制备：将样品用超纯水稀释到1.0mg/ml，取样品150μl，加入1％碳酸氢铵溶液350μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用；/n3)理化对照品制备：将理化对照品用超纯水稀释到1.0mg/ml，取对照品150μl，加入1％碳酸氢铵溶液350μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用。/n

【技术特征摘要】
1.一种特立帕肽的肽图检测方法，包括采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析，其特征在于，所述采用胰蛋白酶对特立帕肽样品进行酶解具体包括：
1)空白样品制备：取1％碳酸氢铵溶液500μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用；
2)供试品制备：将样品用超纯水稀释到1.0mg/ml，取样品150μl，加入1％碳酸氢铵溶液350μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用；
3)理化对照品制备：将理化对照品用超纯水稀释到1.0mg/ml，取对照品150μl，加入1％碳酸氢铵溶液350μl，加入胰蛋白酶溶液4μl，置37℃水浴13-15h，取出后加入冰醋酸溶液30μl终止反应，以10000rpm离心5min，收集上清液，备用。


2.根据权利要求1所述的特立帕肽的肽图检测方法，其特征在于，所述以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中所用的流动相A由0.1％三氟乙酸，10％乙腈和余量水组成，所述流动相A的各组分混匀后，超声脱气30min，备用，临用现配。


3.根据权利要求1所述的特立帕肽的肽图检测方法，其特征在于，所述以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中所用的流动相B由0.1％三氟乙酸，10％水和余量乙腈组成，所述流动相B的各组分混匀后，超声脱气30min，备用，临用现配。


4.根据权利要求1所述的特立帕肽的肽图检测方法，其特征在于，所述以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析中所用的色谱柱为SymmetryC1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘月峰，张梦，李静，樊欣迎，郭静雅，
申请(专利权)人：北京博康健基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11