【技术实现步骤摘要】
一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用
一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程
技术介绍
海藻糖(Trehalose)是由两分子吡喃环葡萄糖以1,1-糖苷键连接而成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、真菌、植物、动物等生物体体内。海藻糖广泛存在于自然界中，有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性等特殊性质，以及生物大分子保护剂等。尤其对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代开始，关于海藻糖生理生化和分子生物学的研究逐渐兴起，现已成为国际上最近开发的新型天然低聚糖之一。酶转化法生产海藻糖是生产的主要途径，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。其中以麦芽糊精或淀粉糖化液为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。目前国内海藻糖生产以大肠杆菌为生产菌株，但由于大肠杆菌生产菌株会产生内毒素，限制了海藻糖在食品和医药领域的应用。枯草芽孢杆菌是食品安全菌株，不产生内毒素，但枯草芽孢杆菌对异源酶的表达量比较低，对异源表达多个联级反应酶的催化效率较低。中国专利文献CN109679887A(申请号：201811490196.1)公开了一种利用高效分泌表达的双酶融合耦合发酵生产海藻糖的方法，该专利技术公开了通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽Pho...
【技术保护点】
1.一种构建同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1、构建自主装模块质粒pDGI-7S6-P
【技术特征摘要】
1.一种构建同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、构建自主装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis，包括如下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD基因片段；
(2)以嗜酸热硫化叶菌SulfolobusacidocaldariusATCC33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段；
(3)以pUC57-spyCatcher质粒为模板PCR扩增spyCatcher基因片段；
(4)利用重叠PCR连接步骤(1)中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤(2)中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段和步骤(3)中的spyCather基因片段，制得P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis融合基因片段；
(5)将可消除抗性的枯草芽孢杆菌amyE基因位点整合载体pDGI-7S6质粒用限制性内切酶BamHI/HindIII进行双酶切，然后与步骤(4)制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到可以消除抗性的无痕整合载体，即为自主装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis；
所述整合载体pDGI-7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71-spc-lox66基因片段替换整合载体pDG1730的第961和第1714碱基之间的壮观霉素抗性基因spc构建而成，并命名pDGI-7S6；
步骤2、构建自组装模块质粒
pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis，包括如下步骤：
a、以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段；
b、以pUC57-spyTag-linker-spyTag质粒为模板扩增spyTag-linker-spyTag基因片段；
c、以嗜酸热硫化叶菌SulfolobusacidocaldariusATCC33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段；
d、利用重叠PCR连接步骤a中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤b中的spyTag-linker-spyTag基因片段、步骤c中的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段制得P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis融合片段；
e、将可消除抗性的枯草芽孢杆菌lacA基因位点整合载体pAX01-7S6质粒用限制性内切酶SacII/BamHI进行双酶切，然后与步骤d制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到无痕整合载体，即为自组装模块质粒pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis；
所述整合载体pAX01-7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71-spc-lox66基因片段插入整合载体pAX01的第2235和第2236碱基之间构建而成，并命名pAX01-7S6；
步骤3、将步骤1和步骤2构建的自组装模块质粒，分别转化进B.subtilisWB800n菌体中，制得重组B.subtilisWB800n，同时将温敏型抗性消除质粒pTSC质粒转入所述重组B.subtilisWB800n中，经变温培养得到可用于食品生产的无痕整合型重组B.subtilisWB800n。
2.如权利要求1所述，重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤(1)中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；
优选的，所述步骤(1)中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
3.如权利要求1所述，重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤(2)中麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；
优选的，所述步骤(3)中spyCatcher基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.7；和SEQIDNO.8所示。
4.如权利要求1所述，重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)或(3)中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMaxMasterMix25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
5.如权利要求1所述，重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的重叠PCR扩增体系如下，总体积为50μl：
启动子P43基因片段4μl，分泌信号肽PhoD基因片段4μl，MTSase基因片段4μl，spyCatcher基因片段4μl，2×PhantaMaxMasterMix25μl，加ddH2O至50μl；
重叠PCR的扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min30sec，10个循环；72℃延伸5min；
重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μl：
重叠体系10μl，10μmol/L上游引物SEQIDNO.12.5μl，10μmol/L下游引物SEQIDNO.82.5μl，2×PhantaMaxMasterMix25μl，加ddH2O到50μl；
重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min30sec，30个循环；72℃延伸5min。
6.如权利要求1所述，重组枯草芽孢杆菌的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：王腾飞，宋龙祥，刘洪玲，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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