一种链球菌DNA酶B抗原及其应用制造技术

本发明专利技术公开了属于基因工程技术领域的一种链球菌DNA酶B抗原及其应用。所述的抗原，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的DNaseB抗原可以高效表达，具有高活性。利用该抗原建立的双抗原夹心法检测抗DNaseB抗体，灵敏度高，特异性好，适用于临床检验。

A Streptococcus DNA enzyme B antigen and its application

【技术实现步骤摘要】
一种链球菌DNA酶B抗原及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种链球菌DNA酶B抗原及其应用。
技术介绍
A族链球菌(groupAstreptococci)，称A组溶血性链球菌或化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)，是人类细菌感染中最重要的病原之一，引起的感染主要有急性咽炎、急性扁桃体炎，也可致肺部感染、猩红热、皮肤软组织感染，并可致全身性感染。该菌也是变态反应性疾病风湿热和急性肾小球肾炎的间接原因。近年来由A族链球菌所引起的严重感染的发病率明显增长，也引起了人们对该类细菌感染更大的关注。链球菌溶血素“O”是A族链球菌产生的一种外毒素，能溶解红细胞，并对机体多种细胞有毒性作用，是A族链球菌的重要代谢产物之一，可刺激机体产生抗链球菌溶血素“O”，简称抗“O”或ASO，人体感染溶血性链球菌后，血清中可出现大量抗链球菌溶血素“O”抗体。检测抗链球菌溶血素“O”可作为链球菌感染后变态反应性疾病的辅助诊断。链球菌DNA酶B(DNaseB)亦称链道酶S(DB)或MF，主要由A、C、G群链球菌产生的一种分泌蛋白，序列高度保守，能降解脓液中具高度粘稠性的DNA，使脓液稀释，促进病菌扩散。DNA酶B对人体有较强的抗原性，刺激机体产生相应抗体，即抗DNA酶B。抗DNA酶B检测是Jones标准所推荐的链球菌感染及其并发症的两种实验诊断方法之一。当机体感染A族链球菌后，机体会产生大量的ASO与抗DNA酶B抗体，它们的抗体动力学相似，区别主要是ASO出现的时间较早，高峰维持的时间较短，一般3-5周达到高峰值，2个月后大多降为正常；而抗DNA酶B出现的时间较晚，该种抗体升高比较慢，高峰时间维持较长，一般维持时间长达3-6个月。由于ASO和抗DNA酶B不同的抗体动力学，因此对于急性A族链球菌感染如急性咽炎、急性扁桃体炎、急性风湿热等，ASO正处于高滴度状态，故应首选ASO；对于慢性感染及感染后引起的自身免疫性疾病，此时ASO滴度已降至正常，而抗DNA酶B却维持在高滴度状态，故应选择抗DNA酶B。由于目前风湿热患者临床表现多为轻微或不典型，加之人体对A族链球菌抗原反应并非均一，约25％的患者在被感染后，可以对某一抗原呈阴性反应，因此ASO和抗DNA酶B联合检测可提高阳性率。有研究证实在急性风湿热和活动期风湿性心脏病患者中，两者联合检测的阳性率均在90％左右，提示ASO和抗DNA酶B联合检测在风湿热的诊断中具有重要的临床价值，有广泛的推广意义。目前，对于抗DNA酶B抗体的检测多采用天然DNaseB，然而，天然DNaseB的纯化工艺复杂，获取成本昂贵。首先发酵GAS以获取大量的含有分泌的DNaseB的培养液，不仅需要较长的生长周期，而且存在严重的安全隐患。其次，得到培养液后的纯化过程繁冗，得率也比较低。第三，天然粗提物包含已知的和未知的链球菌产物，会干扰检测结果并放大检测数据，是检测结果出现偏差，因而无法满足临床检测的需要。另一方面，目前商品化的抗DNA酶B抗体检测试剂多采用微量滴定法和免疫比浊法，不仅操作复杂，而且对抗体浓度变化不敏感。
技术实现思路
为了克服现有技术中的问题，本专利技术首先提供了一种DNaseB抗原，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。其次，本专利技术同时也提供了编码上述DNaseB抗原的核酸序列。关于上述核酸序列，可选的，所述核酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。本专利技术同时也提供了表达上述的DNaseB抗原的表达载体和微生物。关于上述微生物，可选的，所述微生物为细菌，进一步的，所述细菌为大肠杆菌。本专利技术同时也提供了上述抗原、核酸序列、表达载体或微生物在制备检测链球菌感染试剂中的应用。进一步的，本专利技术同时也提供了上述抗原、核酸序列、表达载体或微生物在制备检测抗DNaseB抗体试剂中的应用。本专利技术同时也提供了一种抗DNaseB抗体检测试剂盒，包括上述的DNaseB抗原。上述试剂盒中，可选的，所述试剂盒为抗DNaseB抗体双抗原夹心检测试剂盒。上述试剂盒中，可选的，所述试剂盒还包括包被DNaseB抗原的酶联板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的DNaseB抗原、样品稀释液、洗涤液、TMB显色底物A液、TMB显色底物B液和反应终止液。上述试剂盒中，上述试剂，可选的，分别为：样品稀释液：1％BSA，5mMEDTA，5％山羊血清，0.1％Proclin-300，0.1％Triton-X100，1.78％NaCl，0.04％硫柳汞。洗涤液：5.63％Na2HPO4·12H2O，0.672％NaH2PO4·2H2O，17％NaCl，1％Tween-20。TMB显色底物A液：0.32％柠檬酸(一水合物)，0.06％过氧化氢溶液，2.72％NaAc·3H2OTMB显色底物B液：0.04％EDTA-Na2，0.04％TMB，0.19％柠檬酸(一水合物)，10％丙三醇(甘油)。反应终止液：2mol/LH2SO4。本专利技术的有益效果：本专利技术的DNaseB编码基因，去除不易表达的稀有密码子，其次分析DNaseB氨基酸序列的疏水性，去除影响表达效率的疏水性强的氨基酸序列，并保留绝大部分抗原表位，最后采用融合表达技术将多个抗原优势区段连接到一起进行融合表达，获得高效表达的高活性DNaseB抗原。利用该抗原，本专利技术首次建立了双抗原夹心法检测抗DNaseB抗体，该方法操作简便，灵敏度高，特异性好，非常适用于临床检验。本方法制备的DNaseB基因工程重组抗原产量高、纯度高、活性好、不存在安全风险，并且制备方法简单，低成本，显著优于通过提取方法获得天然抗原，完全适用于研制抗DNaseB抗体免疫检测试剂的需求。附图说明图1为表达的本申请DNaseB抗原的SDS-PAGE电泳图，其中各标号为：M-Marker；1-全菌；2-包涵体；3-纯化抗原。图2为抗原优化前后表达率比较结果。图3为本申请纯化后DNaseB融合优势表位抗原的纯度分析。图4为本申请DNaseB融合优势表位抗原的活性鉴定，其中各标号为：1-非特异性抗体；2-抗DNaseB特异性抗体。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。实施例1本申请的DNaseB融合优势表位抗原的制备一、DNaseB融合优势表位抗原氨基酸序列和编码序列Genebank中的原始的DNaseB(链球菌DNA酶B)全长271个氨基酸，含有43aa的前导肽和成熟蛋白的228个氨基酸，成熟蛋白的序列如序列表中SEQIDNO.3所示，分子量约为25.4kD。本申请的DNaseB抗原(也称，DNaseB融合优势表位抗原，区别于原始的DNaseB)经过基因优化和表位筛选，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。优化后的编码DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNaseB抗原，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNaseB抗原，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。


2.编码权利要求1所述DNaseB抗原的核酸序列。


3.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。


4.表达权利要求1所述的DNaseB抗原的表达载体。


5.表达权利要求1所述的DNaseB抗原的微生物。


6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物为细菌，进一步的，所述细菌为大肠杆菌。

【专利技术属性】
技术研发人员：冯晓燕，张贺秋，王超男，张玲，危利，
申请(专利权)人：东方海洋北京医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11