具有突变的CD28共刺激性结构域的嵌合抗原受体制造技术

本文公开可与过继性细胞转移一起使用以靶向和杀死癌症的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含具有例如通过减少CAR‑T细胞衰竭来增强CAR‑T细胞功能的CD28的细胞质结构域的突变形式的共刺激信号传导区域。还公开被工程化以表达这些CAR的免疫效应子细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。因此，还公开向患有肿瘤相关的抗原表达的癌症的受试者提供抗肿瘤免疫力的方法，所述方法涉及被工程化以表达公开的CAR的所公开的免疫效应子细胞的过继转移。

Chimeric antigen receptor with mutated CD28 costimulatory domain

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有突变的CD28共刺激性结构域的嵌合抗原受体相关申请的交叉引用本申请要求2017年7月7日提交的美国临时申请号62/529,919的优先权，其全部内容通过引用合并于此。序列表本申请包含以电子形式提交的序列表，该序列表是在2018年7月7日创建的名为“320803_2160_序列表_ST25”的ASCII.txt文件。序列表的内容全文并入本文。
技术介绍
手术、放射疗法和化学疗法已成为治疗包括白血病、实体瘤和转移癌在内的癌症的标准方法。作为常规癌症治疗的辅助手段，已经研究直接或间接利用人体免疫系统来缩小或根除癌症的免疫疗法(有时称为生物疗法、生物治疗法或生物反应调节剂疗法)。人们认为，人类免疫系统是用于癌症治疗的未开发资源，一旦正确利用免疫系统的组成部分，就可以开发出有效的治疗方法。抗癌T细胞疗法的一项重大进步是嵌合抗原受体(CAR)，它是一种单链可变片段(scFv)，其衍生自与T细胞受体(TCR)信号信号结构域融合的抗体(Davila,M.L.,etal.,Oncoimmunology,2012.1(9):1577-1583)。第一代CAR的细胞内结构域仅包含CD3δ，而第二代CAR也包括共刺激性结构域，例如CD28或41BB。这些第二代CAR结构域支持在小鼠中高效杀死肿瘤，并导致对患者的CART细胞疗法进行临床评估。据报道，针对B19急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的患者，其完全缓解率达到90％，从而证实靶向CD19的CART细胞的潜力(Davila,M.L.,etal.,SciTranslMed,2014.6(224):224ra25；Maude,S.L.,etal.,NEnglJMed,2014.371(16):1507-17)。然而，不良的CART细胞持久性和过度的T细胞活化分别导致复发和严重的毒性，这表明了解CART细胞生物学的关键需求(Gangadhar,T.C.andR.H.Vonderheide,NatRevClinOncol,2014.11(2):91-9)。此外，在所有第二代CAR中都发现了复发和毒性，这表明在CAR中添加共刺激性结构域可提高疗效，但以生物并发症为代价。专利技术概述如本文所公开的，具有CD28共刺激性结构域的CART细胞在CM细胞中倾向于低水平的强直信号和耗尽表型，并且突变某些CD28亚结构域不能消除CAR信号或细胞因子的产生。因此，可以通过调节CD28共刺激来改善第二代CART细胞功能。本文公开可与过继性细胞转移一起使用以靶向和杀死癌症的嵌合抗原受体(CAR)多肽。公开的CAR包括共刺激性信号传导区域，该共刺激性信号传导区域包括增强CAR-T细胞功能的CD28的细胞质结构域的突变形式。在一些实施方案中，突变形式减少CAR-T细胞的衰竭。CD28结构域包括调节TCR刺激后的信号传导途径的3个细胞内亚结构域(YMNM(SEQIDNO:1)、PRRP(SEQIDNO:2)和PYAP(SEQIDNO:3))。在一些实施方案中，公开的CAR包括增强CAR-T细胞功能(例如减少CAR-T细胞衰竭)的这些亚结构域中一个或多个的突变或缺失。在一些实施方案中，CAR多肽还包括增强CART细胞功能的CD3δ和/或41BB中的一种或多种缺失或突变。至于其他CAR，公开的CAR多肽在胞外结构域中包含配体结合结构域，例如可以结合表达肿瘤相关抗原(TAA)的癌细胞的试剂。公开的多肽还可以包含能够激活免疫效应子细胞的跨膜结构域和胞内结构域。例如，胞内结构域可以包含细胞内信号传导结构域和任选的一个或多个共刺激信号传导区域。配体结合结构域，例如抗TAA结合剂在一些实施方案中是特异性结合TAA的抗体片段。例如，抗原结合结构域可以是特异性结合TAA的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗TAA结合剂是特异性结合TAA的适体。例如，抗TAA结合剂可以是基于其结合TAA的能力选自随机序列库的肽适体。抗TAA结合剂也可以是TAA的天然配体，或其能够结合TAA的变体和/或片段。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是CD3zeta(CD3δ)信号传导结构域。在某些情况下，共刺激性信号传导区域包含一个或多个细胞内信号传导分子的1、2、3或4个细胞质结构域。还公开编码所公开的CAR多肽的分离的核酸序列、包含这些分离的核酸的载体和包含这些载体的细胞。例如，细胞可以是选自下列的免疫效应子细胞：αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和调节性T细胞。在一些实施方案中，当CAR的抗原结合结构域与肿瘤上的TAA结合时，细胞就会表现出抗肿瘤免疫力。还公开一种在患有TAA-表达性癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，包括向所述受试者施用有效量的使用包含突变的CD28共刺激性结构域的公开的TAA-特异性CAR来遗传修饰的免疫效应子细胞。本专利技术的一个或多个实施例的细节在下面的附图和描述中阐明。通过说明书和附图以及权利要求书，本专利技术的其他特征、目的和优点将变得显而易见。附图简述图1是抗小鼠CD19CAR构建体的示意图。逆转录病毒构建体包括具有CD8铰链(H)和跨膜结构域(TM)的抗mCD19scFv(VH/VL)，其后是CD28(m1928z)或41BB(m19-musBBz)和单独的CD3δ或CD3δ(m19z)。阴性对照CAR不包含信号传导结构域(m19Δz)。G/S是甘氨酸-丝氨酸接头。CAR被标记到荧光蛋白报道分子(GFP或Cherry)上。LTR是长末端重复序列SD是剪接供体，SA是剪接受体，y是包装信号。图2A是在Nur77GFP衍生的CART细胞中支持CAR信号传导的CD28亚结构域突变的示意图。显示了被AAAA(SEQIDNO：4)取代的YMNM(SEQIDNO：1)、PRRP(SEQIDNO：2)和PYAP(SEQIDNO：3)序列。图2B是柱状图，显示了用3T3-mCD19刺激的Nur77GFP(百分比GFP+)CD19靶向的CART细胞。刺激后24小时，通过流式细胞术评估Nur77GFP。图3A和3B是柱状图，显示了用表达小鼠CD19的3T3细胞(3T3-mCD19)刺激CD28亚结构域突变体CD19靶向的CART细胞后IFN-γ(图3A)和IL-2(图3B)的分泌。图3C和3D是显示通过流式细胞术评估的CM和EM子集的条形图。图4是显示CD28突变的CART细胞和非突变的CART细胞的生存力的图。从野生型C57BL/6小鼠产生CART细胞，并在自动细胞计数器(BIO-RAD)上通过台盼蓝染色测量细胞活力。图5是显示CD28突变CART细胞和未突变CART细胞增殖的图。从野生型C57BL/6小鼠产生CART细胞，并在第5天通过从初始细胞数到最终细胞产量的倍数变化来评估增殖。图6A至图6D是柱状图，显示了由突变和未突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导区域，其中所述共刺激信号传导区域包含增强CAR-T细胞融合的CD28的细胞质结构域的突变形式。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170707 US 62/529,9191.嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导区域，其中所述共刺激信号传导区域包含增强CAR-T细胞融合的CD28的细胞质结构域的突变形式。


2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述共刺激信号传导区域包含缺乏YMNM亚结构域或在所述YMNM亚结构域中具有无效突变的CD28的细胞质结构域。


3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述共刺激信号传导区域包含缺乏PRRP亚结构域或在所述PRRP亚结构域中具有无效突变的CD28的细胞质结构域。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述共刺激信号传导区域包含缺乏PYAP亚结构域或在所述PYAP亚结构域中具有无效突变的CD28的细胞质结构域。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述CAR多肽由下式限定：
SP–TAA–HG–TM–CSR–ISD；或
SP–TAA–HG–TM–ISD–CSR
其中“SP”表示信号肽，
其中“TAA”表示肿瘤相关的抗原结合区，
其中“HG”表示和任选的铰链结构域，
其中“TM”表示跨膜结构域,
其中“CSR”表示所述共刺激信号传导区域，
其中“ISD”表示细胞内信号传导结构域，和
其中“–”表示二价接头。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3zeta(CD3δ)信号传导...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·L·达维拉，
申请(专利权)人：H·李·莫菲特癌症中心研究所公司，
类型：发明
国别省市：美国;US