测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法技术

本发明专利技术公开了一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC‑MS/MS方法，包括：储备液的制备；将储备液稀释成硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液和内标工作液；正标准品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；质控样品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；样品的检测分析。本发明专利技术所提供的方法，具有提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应、快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好等优点。

HPLC-MS / MS method for the determination of clopidogrel and its inactive metabolites in plasma

【技术实现步骤摘要】
测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法
本专利技术涉及了临床血药浓度监测控制
，具体的是一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法。
技术介绍
氯吡格雷，可用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑及其他动脉循环障碍疾病，如近期发作的脑卒中、心肌梗死和确诊的外周动脉疾病。为了保证药物进入人体后能达到有效的治疗浓度和避免不良反应，临床上通常需要监测药物浓度，结合病人病情等个体化给药剂量的调整，以提高药物疗效，减少毒副反应的发生。因此，采用准确、灵敏、快速的定量分析方法测定氯吡格雷及其非活性代谢物(ClopidogrelImpurity1，简称CCAM)在血浆中的浓度十分必要。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术实施例提供了一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法，其具有灵敏度高、定量准确、检测时间短等优点。本申请实施例公开了：一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法，所述方法中采用氯雷他定和卡马西平-d8作为内标，所述方法包括以下步骤：储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，分别将硫酸氢氯吡格雷、CCAM和氯雷他定加入HPLC甲醇中，配置得到硫酸氢氯吡格雷储备液、CCAM储备液以及氯雷他定储备液；工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述硫酸氢氯吡格雷储备液和所述CCAM储备液分别稀释，获得硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液；用乙腈作为溶剂，将所述氯雷他定储备液和卡马西平-d8加入所述乙腈溶剂中，获得内标工作液；校正标准品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；质控样品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入内标工作液或乙腈以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；在30℃下采用氮气将各上清液吹干，再向各上清液中加入复溶液；封板、涡旋均匀，然后进样分析。具体的，所述复溶液为乙腈体积分数为25％的乙腈水溶液。具体的，所述氯雷他定的浓度为20ng/mL，所述卡马西平-d8的浓度为4ng/mL。具体的，所述方法中，液相色谱参数如下：色谱柱：XbridgeC182.1*50mm，3.5μm，柱温为35℃；流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸水溶液，所述流动相B为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；质谱条件：采用电喷雾离子原，正离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：硫酸氢氯吡格雷的母离子/特征子离子的检测离子对为322.1/212.2，CCAM的母离子/特征子离子的检测离子对为308.2/198.2，氯雷他定的母离子/特征子离子的检测离子对为383.2/337.1，卡马西平-d8的母离子/特征子离子的检测离子对为237.1/194.1。具体的，流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.2min，所述流动相A的体积分数为80％；第0.8～1.00min，所述流动相A的体积分数为40％；第1.80～2.50min，所述流动相A的体积分数为0％；第2.51～2.70min，所述流动相A的体积分数为80％；第2.71～3.30～min，所述流动相A的体积分数为0％；第3.31～4.60min，所述流动相A的体积分数为80％。具体的，对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用的条件包括：在10℃，4000rpm条件下离心15min。具体的，所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液中，所述硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于20～20000ng/mL之间。具体的，所述校正标准品中，所述硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于1.00～1000ng/mL之间。具体的，所述质控样品中，硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于1～750ng/mL之间。具体的，所述空白血浆为食蟹猴血浆。本专利技术至少具有如下有益效果：本方法具有提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应、快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好等优点。为让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例中溶剂样品中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；图2是本专利技术实施例中BK样品中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；图3是本专利技术实施例中QC0样品中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；图4是本专利技术实施例中残留效应中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；图5是本专利技术实施例中质控样品5中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；图6是本专利技术实施例中溶剂样品中CCAM的质谱图；图7是本专利技术实施例中BK样品中CCAM的质谱图；图8是本专利技术实施例中QC0样品中CCAM的质谱图；图9是本专利技术实施例中残留效应中CCAM的质谱图；图10是本专利技术实施例中质控样品5中CCAM的质谱图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本实施例的仪器如下：ShimadzuLC-30AD高效液相色谱仪自动进样器，自动进样器的温度采用10℃柱温箱试药：硫酸氢氯吡格雷、氯吡格雷非活性代谢物(ClopidogrelImpurity1，以下简称CCAM)、氯雷他定、卡马西平-d8、HPLC甲醇、去离子化纯净水、分析纯级乙腈一、储备液的制备用HPLC甲醇作为溶剂，分别将硫酸氢氯吡格雷、CCAM和氯雷他定加入HPLC甲醇中，配置得到硫酸氢氯吡格雷储备液、CCAM储备液以及氯雷他定储备液。上述三种储备液中，相应的化合物的浓度均为1.00mg/mL。二、工作液的制备：用纯乙腈作为溶剂，将上述氯雷他定储备液和卡马西平-d8分别配置，获得内标工作液，在该内标工作液中，氯雷他定的浓度为20.0ng/mL，卡马西平-d8的浓度为4.00ng/mL。采用HPLC甲醇和水作为溶剂，将上述硫酸氢氯吡格雷储备液和CCAM储备液分别通过稀释配置，获得硫酸氢氯吡格雷工作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法中采用氯雷他定和卡马西平-d8作为内标，所述方法包括以下步骤：/n储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，分别将硫酸氢氯吡格雷、CCAM和氯雷他定加入HPLC甲醇中，配置得到硫酸氢氯吡格雷储备液、CCAM储备液以及氯雷他定储备液；/n工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述硫酸氢氯吡格雷储备液和所述CCAM储备液分别稀释，获得硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液；用乙腈作为溶剂，将所述氯雷他定储备液和卡马西平-d8加入所述乙腈溶剂中，获得内标工作液；/n校正标准品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；/n质控样品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；/n样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入所述内标工作液或乙腈以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；在30℃下采用氮气将各上清液吹干，再向各上清液中加入复溶液；封板、涡旋均匀，然后进样分析。/n...

【技术特征摘要】
1.一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法中采用氯雷他定和卡马西平-d8作为内标，所述方法包括以下步骤：
储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，分别将硫酸氢氯吡格雷、CCAM和氯雷他定加入HPLC甲醇中，配置得到硫酸氢氯吡格雷储备液、CCAM储备液以及氯雷他定储备液；
工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述硫酸氢氯吡格雷储备液和所述CCAM储备液分别稀释，获得硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液；用乙腈作为溶剂，将所述氯雷他定储备液和卡马西平-d8加入所述乙腈溶剂中，获得内标工作液；
校正标准品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；
质控样品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；
样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入所述内标工作液或乙腈以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；在30℃下采用氮气将各上清液吹干，再向各上清液中加入复溶液；封板、涡旋均匀，然后进样分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复溶液为乙腈体积分数为25％的乙腈水溶液。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标工作液中，所述氯雷他定的浓度为20ng/mL，所述卡马西平-d8的浓度为4ng/mL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：XbridgeC182.1*50mm，3.5μm，柱温为35℃；
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸水溶液，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王樱桃，胡玲华，
申请(专利权)人：安领生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32