一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术创造提供了一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，主要包括(1)破壁；(2)裂解+结合；(3)清洗；(4)洗脱等步骤。本发明专利技术创造所述的提取方法结合化学破壁法，更适用于真菌DNA提取，更加高效、快速、简便、易操作且更适用于后续PCR扩增过程。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法
本专利技术创造属于分子生物学
，尤其是涉及一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法。
技术介绍
近年来，由于造血干细胞移植、实体器官移植、高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的广泛开展及使用，以及各种导管和尿管的置留等原因，临床上各种侵袭性真菌病感染的发病率及死亡率明显上升。引起侵袭性真菌病的主要真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属和毛霉菌属。据统计，自2000年以来，每年增加10％-20％的临床病例，这已成为医院感染的主要危险。但是，侵袭性真菌感染的诊断面临很多困难，被认为金标准的诊断手段还具有局限性，缺乏典型的临床症状；培养阳性率低，检测时间长；虽然血清学检测是临床侵袭性真菌感染的重要检测方法，但存在一定程度的假阳性及假阴性结果，并且由于其检测技术原理的限制，只能进行真菌属的鉴别，无法进行真菌种间鉴别。与以上传统方法相比，分子生物学技术不仅能实现对侵袭性真菌感染的快速诊断，并能进行菌种鉴定，同时有高特异性、高敏感性等优势，是侵袭性真菌感染诊断的新方向，具有重要的现实意义。通俗来讲，临床分子诊断是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的表达水平而做出诊断的技术。临床分子诊断的材料包括DNA和RNA，这也是后续进行分子诊断的前提，所以重点在于对真菌DNA的提取。真菌细胞都有较厚的细胞壁，真菌细胞壁由几丁质、葡聚糖、半乳聚糖及纤维素等构成，组成复杂，结构致密，具有良好的硬度和强度，难以用简单的方法使其充分裂解，因此，达到理想的破壁效果是真菌研究中的关键步骤之一。目前有许多常见的方法，比如：CTAB法、一步结合加热法、改进的氯化苄法、液氮研磨法、微波法、打击器振荡法等实验室方法，以及Biospin试剂盒、酵母基因组核酸提取试剂盒(天根)等常规试剂盒方法。但是以上方法都存在一定的缺陷：有毒有害成分、耗时长、不便运输保存、试剂盒成本较高，并且最主要问题在于对真菌的提取效果较差，提取效率低，无法用于后续的临床分子诊断过程。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术创造旨在提出一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，以解决上述问题。为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案是这样实现的：一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：S1、培养真菌，离心收集，得到菌体；S2、向菌体中加入山梨醇buffer及破壁酶，充分混匀后孵育，离心收集得到菌体沉淀；S3、向菌体沉淀中加入蛋白酶K及裂解液混匀，加入异丙醇及磁珠悬浮液后，再次振荡混匀；S4、将离心管放入金属浴进行孵育，期间交替进行振荡混匀和静置；S5、将孵育后离心管放置于磁力架静置，磁珠吸附后，吸除液体；S6、取下离心管，加入清洗液，振荡混匀，然后将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，吸除液体；S7、取下离心管，加水，振荡混匀，放入金属浴孵育，期间颠倒混匀；S8、将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移到新离心管中，即得。进一步的，所述步骤S3中裂解液的组成为：5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、450mM三羧甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、450mM氯化钾(KCl)、300mM氢氧化钠(NaOH)、8mM二硫苏糖醇(DTT)、1％曲通(TritonX-100)、0.03％N-月桂酰肌氨酸钠。进一步的，所述步骤S6中清洗液的组份为：0.3M(PH4.0)氯化钾溶液。进一步的，所述步骤S3中蛋白酶K的加入量为20μL，裂解液的加入量为300μL。进一步的，所述步骤S1具体包括如下步骤：1a、使用液体培养基培养真菌，用时36-72小时；1b、取菌体于离心管中，然后以12000r/min的转速离心10min，收集菌体。进一步的，所述步骤S2具体包括如下步骤：向菌体中加入600μL山梨醇buffer，然后加入5μL浓度为10U/μL破壁酶Lyticase，破壁酶的活性为50U,充分混匀，30℃孵育30min，以1800r/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀。进一步的，所述步骤S3中异丙醇的加入量为350μL，磁珠悬浮液的加入量为20μL。进一步的，所述步骤S4具体包括如下步骤：将离心管置于金属浴中65℃孵育15min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次；室温放置5min；振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min。进一步的，所述步骤S5中清洗液的加入量为700μL。进一步的，所述步骤S7具体包括如下步骤：取下离心管，加入100μL水，振荡混匀；放入56℃金属浴孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次。优选地，在步骤S1和S2之间还包括操作如下步骤：(2)将菌体置于离心管中，用冷去离子水清洗3遍；然后将菌体移于50mL离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；(3)离心收集到离心管中，加入500μL磷酸缓冲液，再加8g氧化锆珠(直径3mm)及0.3g氧化锆珠(直径0.2mm)，配平后放入组织破壁仪，设置研磨条件为：1800r/min，研磨时间99s，间隔时间10s，6个循环，一键自动研磨；然后将菌液及氧化锆珠等分开，留菌液。本专利技术提供了一种磁珠法提取真菌DNA的方法，并且结合化学破壁法，更适用于真菌DNA提取，更加高效、快速、简便、易操作且更适用于后续PCR扩增过程。利用磁珠法提取核酸的原理与硅胶膜离心柱相同，该磁珠为商业化成品磁珠，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行过改良和表面修饰，而制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。加入的裂解液，是一种蛋白变性剂，使蛋白质变性，破坏真菌细胞结构，从而将DNA与蛋白质等杂质分离开来，磁珠可以特异的吸附DNA，通过清洗，去除DNA以外的蛋白质、RNA等杂质，再进行洗脱解离吸附在磁珠上的DNA,从而从真菌细胞中分离得到纯度及浓度较高的DNA。相对于现有技术，本专利技术创造所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法具有以下优势：(1)本专利技术选择化学方法进行破壁，反复试验出最优的破壁酶Lyticase及蛋白酶K的组合；若为更难破壁的曲霉菌属，在此之外，增加物理方法进行破壁，反复试验出最优组织破壁仪及氧化锆珠组合，能完全将曲霉属真菌破壁。(2)本专利技术将裂解与结合合并为一步，即步骤3；同时使用自行配制经过反复优化的裂解液，能更好的与破壁过程衔接，减少步骤，达到最优的破壁效果，提高得率。(3)本专利技术在裂解与结合过程中使用磁珠，避免使用离心机，缩短时间，减少污染，提高效率，充分利用磁珠，磁珠对于核酸有更好的吸附作用；在破壁得到更多核酸的前提下，磁珠结合更多的核酸，更充分的提高核酸提取的浓度。(4)常规清洗过程需要两种清洗液清洗三次，本专利技术采用自行配制且经过反复优化的清洗液，仅需清洗一次，减少清洗步骤，从而大大减少核酸的清洗损失率，与前面步骤结合，更本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1、培养真菌，离心收集，得到菌体；/nS2、向菌体中加入山梨醇buffer及破壁酶，充分混匀后孵育，离心收集得到菌体沉淀；/nS3、向菌体沉淀中加入蛋白酶K及裂解液混匀，加入异丙醇及磁珠悬浮液后，再次振荡混匀；/nS4、将离心管放入金属浴进行孵育，期间交替进行振荡混匀和静置；/nS5、将孵育后离心管放置于磁力架静置，磁珠吸附后，吸除液体；/nS6、取下离心管，加入清洗液，振荡混匀，然后将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，吸除液体；/nS7、取下离心管，加水，振荡混匀，放入金属浴孵育，期间颠倒混匀；/nS8、将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移到新离心管中，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、培养真菌，离心收集，得到菌体；
S2、向菌体中加入山梨醇buffer及破壁酶，充分混匀后孵育，离心收集得到菌体沉淀；
S3、向菌体沉淀中加入蛋白酶K及裂解液混匀，加入异丙醇及磁珠悬浮液后，再次振荡混匀；
S4、将离心管放入金属浴进行孵育，期间交替进行振荡混匀和静置；
S5、将孵育后离心管放置于磁力架静置，磁珠吸附后，吸除液体；
S6、取下离心管，加入清洗液，振荡混匀，然后将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，吸除液体；
S7、取下离心管，加水，振荡混匀，放入金属浴孵育，期间颠倒混匀；
S8、将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移到新离心管中，即得。


2.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中裂解液的组成为：5mM乙二胺四乙酸、450mM三羧甲基氨基甲烷、450mM氯化钾、300mM氢氧化钠、8mM二硫苏糖醇、1％曲通、0.03％N-月桂酰肌氨酸钠。


3.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中异丙醇的加入量为350μL，磁珠悬浮液的加入量为20μL。


4.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中蛋白酶K的加入量为20μL，裂解液的加入量为300μL。


5.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S6中清洗液的组份为：0.3MPH值为4.0的氯化钾溶液。


6.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎香言，王志贤，盛长忠，周泽奇，粟艳，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12