PAX6基因或其表达产物在制备抑制纤维化的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了PAX6基因或其表达产物在制备抑制纤维化的药物中的应用。本发明专利技术的实验证实PAX6能够通过抑制纤维化促进因子TGFβ，促进纤维化抑制因子IL1R2、CXCL10，从而起到保护心脏抑制纤维化的作用，因此PAX6在心脏中是一个潜在的全新的治疗心脏纤维化从而预防心衰的重要靶点。

【技术实现步骤摘要】
PAX6基因或其表达产物在制备抑制纤维化的药物中的应用
本专利技术涉及基因领域，尤其涉及PAX6基因或其表达产物在制备抑制纤维化的药物中的应用。
技术介绍
心脏纤维化是大量心脏疾病中常见的一种重要的病理过程。心脏纤维化最主要的特点是心肌中细胞外基质的大量聚集。细胞外基质的过度沉积会导致心脏顺应性降低以及舒张功能障碍。心脏纤维化的进一步发展会导致心输出量的降低最终导致心力衰竭。心脏成纤维细胞是心肌组织中提供结构支持的主要细胞类型。在各种类型的心脏损伤下，心脏成纤维细胞可被激活分化为肌成纤维细胞，从而具有更有效的分泌细胞外基质蛋白的兼具成纤维细胞以及平滑肌细胞特性的特殊细胞类型。重要的是，调控心脏成纤维细胞分化从而促进细胞外基质沉积的分子机制尚未完全阐明。转录因子PAX6的基因定位在染色体11p13区域，它是一个在演化过程中高度保守的PAIREDBOX家族的成员。全长的PAX6包含422个氨基酸，它的蛋白结构特点是包含一个长配对结构域(longpaireddomain，PD)以及一个同源异性结构域(homeodomain，HD)，并且有两个DNA结合域。关于PAX6目前的研究主要围绕在眼睛、中枢神经系统、胰岛细胞、嗅觉系统的早期发育过程中。然而关于PAX6在心脏中，特别是心脏成纤维细胞中的作用尚不清楚。值得注意的是，一项研究报道了转录因子PAX6对于DNA的结合活性在生理性和病理性心肌肥大中具有相反的调节作用。生理性肥厚的特点是收缩功能正常或者增强，心脏结构和组织结构均正常。相反的，病理性肥大常常伴随着纤维化重塑的增加，以及其他经常发展为心力衰竭的细胞功能障碍。因此，以上内容提示PAX6可能在心脏纤维化的过程中发挥作用。通常认为TGFβ在多种组织和器官中是促纤维化因子。在晶状体中，TGFβ诱导上皮间质转化，研究发现在此过程中PAX6表达水平降低。另外，有研究报道在神经外胚层发育过程中，PAX6可能通过激活miR135b的作用从而抑制TGFβ和BMP信号通路。然而，PAX6能否抑制心脏纤维化成为一个全新的临床治疗心脏纤维化的靶点尚不得而知，亟需进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的抑制细胞纤维化的药物。为了实现本专利技术的目的，拟采用如下技术方案：本专利技术的目的之一是提供PAX6基因或其表达产物在制备抑制纤维化的药物中的应用。本申请的专利技术人通过生物化学、分子生物学、细胞学研究手段，研究发现PAX6表达水平在小鼠以及小鼠成纤维细胞纤维化模型等病理模型中显著下降。后续使用小干扰RNA的技术手段通过小干扰RNA转染成纤维细胞的方式，利用siRNA敲减降低细胞PAX6蛋白水平，从而明确PAX6对小鼠心脏功能的作用。这一发现是本申请的专利技术人首次发现的，并且是出乎意料的。本专利技术另一方面涉及PAX6基因表达促进剂在制备抑制纤维化的药物中的应用。对于PAX6基因表达促进剂而言，没有特别的限定，包括但不限于过表达PAX6、含有PAX6基因的载体。有报道高胰岛素水平会上调Pax6表达，同样IGF-2也可以。有报道microRNA可以促进PAX6基因表达，例如过表达miR-7、miR-375以及拮抗miR-365均可促进PAX6基因表达。因此，PAX6基因表达促进剂还可以包括胰岛素上调剂、IGF-2、过表达miR-7、miR-375以及拮抗miR-365等。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的纤维化是指心脏纤维化、胰脏纤维化或肺脏纤维化。虽然本专利技术的发现优选应用于人体或动物体的细胞纤维化，但是，本专利技术还涉及PAX6基因或其表达产物在抑制体外心脏成纤维细胞增殖中的应用。本专利技术同样还涉及PAX6基因敲除试剂在促进体外心脏成纤维细胞增殖中的应用。更进一步的，本专利技术还涉及PAX6基因或其表达产物在体外心脏成纤维细胞中抑制纤维化促进因子TGFβ以及促进纤维化抑制因子IL1R2和CXCL10中的应用。本申请的实验结果显示使用小RNA干扰PAX6后，纤维化抑制因子IL1R2、CXCL10的蛋白水平降低，纤维化促进因子TGFβ的蛋白水平升高。本专利技术还涉及PAX6基因或其表达产物通过抑制纤维化促进因子TGFβ以及促进纤维化抑制因子IL1R2和CXCL10在保护心脏以及抑制细胞纤维化中的应用。实验证实PAX6能够通过抑制纤维化促进因子TGFβ，促进纤维化抑制因子IL1R2、CXCL10，从而起到保护心脏抑制纤维化的作用，因此PAX6在心脏中是一个潜在的全新的治疗心脏纤维化从而预防心衰的重要靶点。本专利技术首次提供了PAX6作为新的重要的治疗心脏纤维化的靶点的新应用。特别是，本专利技术首先通过小干扰RNA干扰转录因子PAX6的表达，从而阻断其对下游基因的转录的促进作用，使得其下游多个纤维化抑制因子丧失功能，从而验证了PAX6对于纤维化的抑制作用，因此促进PAX6对下游基因靶基因的调控活性有助于抑制纤维化的发生。本申请的实验证实PAX6能够通过抑制纤维化促进因子TGFβ，促进纤维化抑制因子IL1R2、CXCL10，从而起到保护心脏抑制纤维化的作用，因此PAX6在心脏中是一个潜在的全新的治疗心脏纤维化从而预防心衰的重要靶点。附图说明图1：实时荧光定量PCR检测心脏纤维化心脏组织中转录因子PAX6的mRNA的水平。图2：蛋白质印迹法验证转录因子PAX6在小鼠AngII刺激构建的心脏纤维化模型中的蛋白水平。图2A：蛋白质印迹法利用PAX6抗体检测健康心脏组织以及纤维化心脏组织中的PAX6蛋白水平。图2B：PAX6蛋白印迹法检测的蛋白含量的定量及统计分析结果。图3：实时荧光定量PCR检测血管紧张素刺激后心脏成纤维细胞中转录因子PAX6的mRNA的水平。图4：免疫荧光染色分析转录因子PAX6在成纤维细胞的AngII刺激环境下的蛋白表达水平。圈出的荧光表示细胞核的位置，其余荧光表示PAX6的位置以及荧光强度。图5：蛋白质印迹法验证转录因子PAX6、纤维化标志物fibronectin、αSMA和ColI在成纤维细胞的AngII病理刺激环境下蛋白质的表达水平。图5A：蛋白质印迹法利用PAX6、fibronectin、αSMA和ColI抗体检测心脏成纤维细胞血管紧张素II刺激后的PAX6、fibronectin、αSMA和ColI蛋白水平。图5B：PAX6、fibronectin、αSMA和ColI蛋白印迹法检测的蛋白含量的定量及统计分析结果。图6：蛋白质印迹法检测siRNA转染敲减成纤维细胞中的PAX6后，转录因子PAX6、纤维化标志物fibronectin、αSMA和ColI的蛋白表达水平。图6A：敲减PAX6以后，PAX6、纤维化标志物fibronectin、αSMA和ColI的蛋白水平。图6B：PAX6、fibronectin、αSMA和ColI蛋白印迹法检测的蛋白含量的定量及统计分析结果。图7：染色质免疫共沉淀实验检测转录因子PAX6对其可能的下游基因的启动子的结合能力。图7A-图7C：利用对照IgG和PAX6抗体进行染色质免疫共沉淀实验，检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PAX6基因或其表达产物在制备抑制纤维化的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.PAX6基因或其表达产物在制备抑制纤维化的药物中的应用。


2.PAX6基因表达促进剂在制备抑制纤维化的药物中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，所述的PAX6基因表达促进剂包括过表达PAX6、含有PAX6基因的载体。


4.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，所述的纤维化是指心脏纤维化、胰脏纤维化或肺脏纤维化。


5.PAX6基因或其表达产物在抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：张幼怡，肖晗，李明喆，冯晔囡，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：北京;11