利用唯一分子标识符的文库制备的方法和系统技术方案

用于进行与微生物相关联的测序的方法100和/或系统200或文库制备的实施方案可以包括：制备与一个或多个靶标相关联的一组基于唯一分子标识符(UMI)的分子；制备一组基于测序的引物；基于一组基于UMI的分子，和与一个或多个靶标相关联的一个或多个样品，来生成一组经标记的靶分子；和/或，基于经标记的靶分子和一组基于测序的引物，来生成一组准备测序的经标记的靶分子。

Method and system of library preparation using unique molecular identifier

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用唯一分子标识符的文库制备的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求于2017年6月20日提交的美国临时申请序列号62/522,293和于2017年11月06日提交的美国临时申请序列号62/582,162的权益，上述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文中。
本公开总体上涉及基因组学和分子生物学。
技术介绍
下一代测序(NGS)技术(例如，NGS平台)可以降低DNA测序和/或其他核酸测序的成本，提高所获得的信息的质量，和/或提高测序过程的可扩展性。NGS技术可以促进以高分析深度，对少量到大量的DNA和/或其他核酸样品进行测序，从而可以允许对精确的DNA靶序列和/或其他合适的序列进行检测和解密。可以同时对不同的核酸(例如，不同的DNA核酸等)的混合物进行分析，从而可以促进对复杂混合物的组成(例如，从复杂生态群落，包括微生物等，提取的DNA和/或其他核酸)，和/或来自保守序列池的罕见DNA序列变异体(例如，较大组织的少量细胞中生成罕见的突变等)进行分析。构建用于NGS和/或其他测序方法的测序文库可以包括文库制备过程(例如，DNA操纵、扩增等)，但文库制备过程可能引入多种偏差(例如，关于不同的靶标如DNA靶标，关于靶标之间的比率，等等)。另外，测序读取序列(read)的数量不一定代表核酸分子(例如，DNA分子)在文库或原始混合物中的正比例，从而在生成绝对定量数据(例如，所分析的原始生物样品的组成的精确数量或估值，等等)方面可能存在困难。此外，NGS技术和/或其他合适的测序技术可用于扩增子关联测序(例如，与单一或少量基因区域相关联的分析，例如用于识别生物样品中的一个或多个微生物类群，等等)，或宏基因组关联测序(例如，与微生物群落和/或生物样品的其他合适的生态群落，如包括DNA的整个群落，相关联的分析，这与对单一基因扩增子的分析相对，等等)。然而，扩增子关联测序或宏基因组关联测序各自均具有独特的优点和缺点。附图说明图1包括方法实施方案的变型的流程图；图2包括方法实施方案的变型的流程图；图3包括方法实施方案的变型的流程图；图4包括方法实施方案的变型的流程图；图5包括方法实施方案的变型的流程图；图6包括对于与经典测序引物或与基于UMI的引物(包括4NUMI区域)组合的16S测序文库，所分配的读取序列的对比的具体实施例；图7包括对于与基于UMI的引物(包括4NUMI区域或8NUMI区域)组合的16S测序文库，所分配的读取序列的对比的具体实施例；图8包括对于使用基于UMI的引物(包括8NUMI区域)的PCR过程，通过添加标记促进分子改进靶标扩增的具体实施例；图9A至图9B包括当使用4NUMI区域、8NUMI区域和标记促进分子时，每一样品所分配的UMI总数的对比的具体实施例；图10A至图10B包括当使用4NUMI区域、5NUMI区域和标记促进分子时，每一样品所分配的测序读取序列总数的对比的具体实施例；图11A至图11B包括当使用4NUMI区域、8NUMI区域和标记促进分子时，每一样品所分配的唯一UMI百分比的对比的具体实施例；图12包括接头区域，对于利用基于UMI的引物(包括8NUMI区域)进行16S扩增的效果的具体实施例。具体实施方式以下对实施方案的描述并非意在将本专利技术限制为这些实施方案，而是使本领域技术人员能够进行实现和使用。1.概述如图1和图4所示，用于与微生物相关联的测序(例如，下一代测序(NGS)，等等)的文库制备方法100的实施方案可以包括：制备(例如，确定、生成等)与一个或多个靶标(例如，一组核酸靶标；与微生物相关联的靶标；等等)相关联的一组基于唯一分子标识符(uniquemolecularidentifier，UMI)的分子(例如，基于UMI的引物等)S110；制备一组基于测序的引物(例如，适于促进与微生物相关联的测序，如下一代测序；等等)S120；基于所述一组基于UMI的分子，和与所述一个或多个靶标(例如，一种或多种生物样品，包括与一个或多个核酸靶标相关联的核酸；等等)相关联的一种或多种生物样品(例如，至少一种生物样品)，生成一组经标记的靶分子S130；和/或，基于所述经标记的靶分子和所述一组基于测序的引物，生成一组准备测序的、经标记的靶分子(例如，准备NGS的经标记的靶分子；等等)S140。在一个具体实施例中，方法100(例如，用于与微生物相关联的NGS，等等)可以包括：制备与一组核酸靶标相关联的一组基于UMI的引物(例如，基于UMI的引物，包括与所述一组核酸靶标中的一个或多个核酸靶标序列互补的基因序列；等等)，该一组核酸靶标与微生物相关联，其中所述一组基于UMI的引物中的每一基于UMI的引物均包括UMI区域、靶标关联区域、接头区域(例如，定位在UMI区域与靶标关联区域之间；等等)和/或衔接子区域(例如，包括外部衔接子区域，该外部衔接子区域被配置为促进后续处理，用于制备准备测序的分子；等等)，其中UMI区域包括一组随机“N”碱基，其中每一N碱基均选自“A”碱基、“G”碱基、“T”碱基和“C”碱基中的任一种，其中靶标关联区域与所述一组核酸靶标中的至少一个核酸靶标相关联(例如，一靶标关联区域，其包括与所述至少一个核酸靶标序列互补的基因序列；等等)；制备一组基于测序的引物，其中，所述一组基于测序的引物中的每一基于测序的引物均包括衔接子区域(例如，与基于UMI的引物的衔接子区域不同、相似或相同；等等)，该衔接子区域与NGS相关联(例如，一衔接子区域，其包括被配置成促进使用一种或多种NGS技术进行NGS的测序衔接子，和/或包括与基于UMI的引物衔接子区域的外部衔接子区域相关联的外部衔接子区域；等等)，和/或包括索引区域(例如，测序索引区域，用于促进不同样品的组合标记；用于促进多重化；等等)；利用所述一组基于UMI的引物，和与所述一组核酸靶标相关联的至少一种生物样品，进行第一扩增过程(例如，第一聚合酶链反应(PCR)过程，等等)，来生成一组经标记的靶分子；和，利用所述经标记的靶分子和所述一组基于测序的引物，进行第二扩增过程(例如，第二PCR过程，等等)，来生成一组准备NGS的、经标记的靶分子。附加或可选地，如图2、图3和图5所示，方法100的实施方案可以包括制备组合测序文库S150，其中组合测序文库与和微生物相关联的扩增子关联测序和宏基因组关联测序相关联。在实施方案中，方法100(例如，方法100的实施方案的多个部分包括制备组合测序文库，等等)可以包括：利用一组扩增子生成引物(例如，基于UMI的引物等)，和来自与微生物相关联的至少一种生物样品的一组靶标，进行扩增过程(例如，第一PCR过程；等等)，来生成一组靶标关联扩增子S152；基于对来自所述至少一种生物样品的一组总核酸进行处理(例如，将mRNA转化为cDNA；进行靶标捕获过程；片段化；等等)，来生成与微生物群落(例如，对应于微生物；等等)相关联的一组宏基因组关联片段S154；和/或，基于所述一组靶标关联扩增子、所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于下一代测序(NGS)的文库制备的方法，所述方法包括：/n制备一组基于唯一分子标识符(UMI)的引物，所述一组基于UMI的引物与一组核酸靶标相关联，其中，所述一组基于UMI的引物中的每一基于UMI的引物均包括：/nUMI区域，包括一组随机“N”碱基，其中，每一随机“N”碱基均选自“A”碱基、“G”碱基、“T”碱基和“C”碱基中的任一种，和/n靶标关联区域，与所述一组核酸靶标中的至少一个核酸靶标相关联；/n制备一组基于测序的引物，其中，所述一组基于测序的引物中的每一基于测序的引物均包括与NGS相关联的衔接子区域；/n利用所述一组基于UMI的引物，和与所述一组核酸靶标相关联的至少一种样品，进行第一扩增过程，生成一组经标记的靶分子；和/n利用所述经标记的靶分子和所述一组基于测序的引物，进行第二扩增过程，生成一组准备NGS的经标记的靶分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170620 US 62/522,293;20171106 US 62/582,1621.一种用于下一代测序(NGS)的文库制备的方法，所述方法包括：
制备一组基于唯一分子标识符(UMI)的引物，所述一组基于UMI的引物与一组核酸靶标相关联，其中，所述一组基于UMI的引物中的每一基于UMI的引物均包括：
UMI区域，包括一组随机“N”碱基，其中，每一随机“N”碱基均选自“A”碱基、“G”碱基、“T”碱基和“C”碱基中的任一种，和
靶标关联区域，与所述一组核酸靶标中的至少一个核酸靶标相关联；
制备一组基于测序的引物，其中，所述一组基于测序的引物中的每一基于测序的引物均包括与NGS相关联的衔接子区域；
利用所述一组基于UMI的引物，和与所述一组核酸靶标相关联的至少一种样品，进行第一扩增过程，生成一组经标记的靶分子；和
利用所述经标记的靶分子和所述一组基于测序的引物，进行第二扩增过程，生成一组准备NGS的经标记的靶分子。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一组基于UMI的引物中的每一基于UMI的引物还包括接头区域，所述接头区域不与和所述靶标关联区域相关联的至少一个核酸靶标完全互补。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述接头区域包括少于21个碱基的长度。


4.根据权利要求2所述的方法，其中，对于所述一组基于UMI的引物中的每一基于UMI的引物，所述接头区域位于所述UMI区域与所述靶标关联区域之间。


5.根据权利要求2所述的方法，
其中，所述一组基于UMI的引物中的每一基于UMI的引物还包括与所述NGS相关联的外部衔接子区域，
其中，所述一组经标记的靶分子包括所述外部衔接子区域，和
其中，生成所述一组准备NGS的经标记的靶分子包括，所述一组基于测序的引物，在所述经标记的靶分子的外部衔接子区域处，与所述经标记的靶分子退火。


6.根据权利要求1所述的方法，其中，生成所述一组经标记的靶分子包括，利用所述一组基于UMI的引物、至少一种生物样品和一组标记促进分子来进行所述第一扩增过程，其中所述一组标记促进分子包括MgCl2、二甲基亚砜(DMSO)、热稳定核酸结合蛋白、甜菜碱、甲酰胺、吐温、Triton、NP-40、四甲基氯化铵(TMAC)和牛血清白蛋白(BSA)中的至少一种。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述热稳定核酸结合蛋白包括热稳定单链DNA结合蛋白，并且
其中，生成所述一组经标记的靶分子包括，利用所述一组基于UMI的蛋白、至少一种样品和所述一组标记促进分子来进行所述第一扩增过程，所述一组标记促进分子包括MgCl2和所述热稳定单链DNA结合蛋白。


8.根据权利要求1的方法，其中，生成所述一组经标记的靶分子包括，利用所述第一扩增过程的产物来进行纯化过程，以从所述第一扩增过程的产物中去除所述一组基于UMI的引物中的基于UMI的引物。


9.根据权利要求1所述的方法，
其中，所述第一扩增过程包括第一聚合酶链反应(PCR)过程，
其中，所述第二扩增过程包括第二PCR过程，
其中，所述一组基于测序的引物中的每一基于测序的引物还包括索引区域，所述索引区域被配置为促进与NGS相关联的多重化；和
其中，生成所述一组准备NGS的经标记的靶分子包括，利用所述经标记的靶分子和所述一组基于测序的引物，基于所述第二PCR过程，将所述索引区域和所述衔接子区域添加至所述一组经标记的靶分子中的经标记的靶分子。


10.一种用于下一代测序(NGS)测序的文库制备的方法，所述方法包括：
利用一组扩增子生成引物和来自至少一种样品的一组核酸靶标，基于第一扩增过程，生成一组靶标关联扩增子；
基于对来自所述至少一种样品的一组总核酸进行处理，生成一组宏基因组关联片段；
基于所述一组靶标关联扩增子、所述一组宏基因组关联片段和一组基于测序的引物，生成一组准备测序的靶分子，其中，所述一组准备测序的靶分子与所述一组核酸靶标相关联。


11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述一组扩增子生成引物包括：
第一子集的扩增子生成引物，所述第一子集的每一扩增子生成引物均包括：第一扩增子关联衔接子区域，和，与所述一组核酸靶标中的至少一个核酸靶标的正...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z·阿普泰，J·里奇曼，D·阿尔莫纳西德，J·吉门尼兹，R·奥尔蒂斯，E·莫拉莱斯，P·科瓦鲁比亚斯，E·奥利瓦雷斯，N·奥尔丹尼斯，L·莱奥，
申请(专利权)人：普梭梅根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US