本公开内容提供了例如通过灌注细胞培养，在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括在培养基中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞，所述培养基包含有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素E2、或其衍生物和/或前体。脂质或脂质代谢产物或其组合可以导致生长抑制和/或增加的生产率，伴随减少的细胞流出。本公开内容还提供了通过在培养基中培养细胞用于增加细胞培养的生产率的方法，所述培养基包含有效量的选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素E2、或其衍生物和/或前体。本公开内容还提供了用于以增加的生产率生产治疗性蛋白质的培养基，其中所述培养基包含选自以下的一种或多种脂质或脂质代谢产物：亚油酸、花生四烯酸和前列腺素E2、或其衍生物和/或前体。
Perfusion medium
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】灌注培养基相关申请的交叉引用本申请要求于2017年10月13日提交的美国临时申请序列号62/571,915的优先权利益，所述美国临时申请整体引入本文作为参考。
本专利技术涉及改善的细胞培养基和方法，相对于现有技术方法，所述细胞培养基和方法实现更大的细胞比生产率以及更好的持续和/或维持的活力。本专利技术进一步涉及使用新的和改善的细胞培养基的基于脂质的添加剂，所述添加剂部分通过有效地抑制在细胞培养期间，例如在灌注细胞培养的生产阶段期间的细胞生长，来更有效地维持细胞培养活力并且增加细胞比生产率。更特别地，本专利技术涉及在灌注细胞培养方法期间(例如，在生产阶段期间)使用有效量的一种或多种脂质或脂质代谢产物添加剂，包括亚油酸、花生四烯酸和前列腺素E2、或其衍生物和/或前体，其导致在生产期间的生长抑制，伴随同时减少的细胞流出(cellbleed)，维持的高细胞活力和/或增加的细胞特异性产物滴度。更特别地，本专利技术涉及细胞培养基，其包含有效量的亚油酸、花生四烯酸和前列腺素E2、或其衍生物和/或前体中的一种或多种，用于在灌注细胞培养方法期间，且特别是在生产阶段期间使用，其导致改善和/或维持的细胞活力和/或增加的细胞比生产率。本专利技术还涉及通过经由遗传和/或生化手段增加亚油酸、花生四烯酸和/或前列腺素E2的合成，用于抑制处于灌注状态的细胞生长的方法。
技术介绍
三种方法通常在商业过程中用于通过哺乳动物细胞培养的重组蛋白质生产：分批培养、补料分批培养和灌注培养。基于灌注的方法提供了超过分批和补料分批方法的潜在改善，包括改善的产品质量和稳定性、改善的可扩展性以及增加的细胞比生产率。与分批和补料分批生物反应器不同，灌注系统涉及用过的培养基的不断去除。通过不断去除用过的培养基并且用新培养基替换其，营养素水平得到更好地维持，其同时优化生长条件并去除细胞废物。减少的废产物减少了对细胞和表达产物的毒性。因此，灌注生物反应器通常导致显著更少的蛋白质降解以及因此更高质量的产物。还可以更快速且连续地收获且纯化产物，其在生产不稳定的产物时特别有效。灌注生物反应器也更容易扩展。与传统的分批或补料分批系统相比，灌注生物反应器提供了关于可扩展性和/或需求增加的几个优点。作为其中一个，灌注生物反应器尺寸较小，并且可以以较小的体积产生相同的生产率(即产物产率)。公认的是，与补料分批生物反应器相比，灌注生物反应器可以以5至20倍的浓度起作用。例如，100升的灌注生物反应器可以产生与1,000升的补料分批生物反应器相同的产物产率。因此，可以设想使用1,000升的灌注生物反应器替换典型的10,000升的传统分批补料生物反应器，而不负面影响总体生产率。当扩大生产时，这个显著优点转变成较小的空间需求。这也可以转变成一系列优点，所述优点涉及更低的操作效用、更少的基础设施、更少的劳力、减少的设备复杂性、连续的收获和增加的产物产率。实现高细胞培养密度负责灌注系统的更大生产率。在典型的大规模补料分批商业细胞培养过程中，可以达到10-50x106个细胞/mL的细胞密度。然而，对于基于灌注的生物反应器，已实现了>1x108个细胞/mL的极高细胞密度。另外，在灌注模式下，通过用过的培养基的不断补给，高细胞数目持续长得多的时间段。关于灌注生物反应器中的增加时间段的较高细胞密度部分解释了其更有效的性能。典型的灌注培养从分批培养开始，持续一天或更多天，以允许快速的初始细胞生长和生物量积累，随后为在培养的生长和生产阶段自始至终，向培养物中连续、分步和/或间歇地添加新鲜的灌注培养基，以及同时去除用过的培养基，伴随细胞的保留。各种方法例如沉降、离心或过滤可以用于去除用过的培养基，同时维持细胞。已利用了一小部分的工作体积/天直到许多个工作体积/天的灌注流速。尽管连续灌注系统具有超过传统的分批补料和分批系统的众多优点，但在灌注生物反应器在生物制品制造行业中变得更广泛地接受并利用之前，仍然存在许多挑战。例如，由于去除和补给培养基的连续循环，灌注生物反应器消耗比传统的分批补料系统显著更大体积的培养基。另外，一般缺乏足够的传感器技术用于实时直接评估产物质量，例如蛋白质折叠、聚集、糖基化、氧化和污染—其目前只能通过采样和分析来确定。具有此类技术能力将极大地支持长期稳态灌注的操作。另一个限制是一般缺乏可用的灌注生物处理建模软件，其在很大程度上是由于缺乏有关基于灌注的系统的强数据源。参见E.Langer和R.Rader，“ContinuousBioprocessingandPerfusion:WiderAdoptionComingasBioprocessingMatures,”BioProcessJ，2014；13(1):43-49，其引入本文作为参考。需要改善的一个至关重要的领域是开发更好的灌注生物反应器培养基。与在分批培养中生长的细胞的公认知识相比，关于在灌注中生长的细胞的营养需求可用的科学数据相对较少。参见BSargent，“ArePerfusionCellCultureSystemstheFutureforCell-CultureBasedBiomanufacturing,”TheCellCultureDish，2012年2月3日，可在线获得。在一定程度上，培养基中的近期改善已实现了更高的活细胞密度，并且依次又实现了在灌注过程中的更高滴度。然而，较高的活细胞密度可以造成其它问题。特别地，这些升高的活细胞密度可能变得不可持续，导致减少的培养物活力、缩短的灌注培养运行以及伴随的生产率减少。因此，在执行灌注细胞培养的同时，细胞培养基的设计在实现更大的细胞健康、活力和生产率中具有关键的重要性。需要对灌注细胞培养培养基的设计和培养方法的改善，以克服本领域的不足和挑战。连续灌注细胞培养系统面临的另一个问题是维持恒定的活细胞密度的挑战，并且因而，维持更健康且更有生产力的细胞培养。这通常已通过允许“细胞流出”来解决。在细胞流出期间，以足以允许稳态灌注细胞培养的速率，将细胞取出并作为废物丢弃。依次地，这使活细胞密度保持恒定。然而，细胞流出是浪费的，因为即使去除的细胞含有目的产物，它们也被丢弃。因此，任何量的细胞流出都负面影响过程效率、产物回收以及最重要的产物损失。细胞流出率由细胞生长速率决定。更快的倍增时间也需要更高的细胞流出，以维持恒定的细胞密度，并且因而更多的浪费。作为细胞流出的替代方法，其它人已尝试化学添加剂来减慢细胞生长速率。例如，Du等人(BiotechnologyandBioengineering，第112卷，No.1，2015年1月)报告了小分子细胞周期抑制剂的使用，以控制生长且改善细胞培养生产力。在WO2014/109858中发现了类似的公开内容，其公开了CDK4抑制剂在细胞培养例如分批、补料分批和灌注培养中的使用。Du等人进一步教导了CDK4/6抑制剂特异性地抑制细胞周期，而不影响其它细胞靶。其它细胞生长抑制剂并未得到公开。因此，有效地抑制处于灌注状态的细胞生长并避免细胞流出的需要的另外方法和试剂将显著帮助推进本领域。灌注生物反应器面临的另外一个问题是本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：在包含有效量的一种或多种脂质或脂质代谢产物的培养基中培养所述哺乳动物细胞，其中所述一种或多种脂质或脂质代谢产物包含500-2000μM亚油酸、100-600μM花生四烯酸、0.0001-100μM前列腺素E2、或其衍生物和/或前体。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171013 US 62/571,9151.一种在细胞培养中培养表达异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其包括：在包含有效量的一种或多种脂质或脂质代谢产物的培养基中培养所述哺乳动物细胞，其中所述一种或多种脂质或脂质代谢产物包含500-2000μM亚油酸、100-600μM花生四烯酸、0.0001-100μM前列腺素E2、或其衍生物和/或前体。
2.权利要求1的方法，其中所述培养基包含脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体中的至少两种，优选地
(a)其中所述培养基包含浓度为100-300μM的花生四烯酸和浓度为500-1800μM的亚油酸，或
(b)其中所述培养基包含与浓度为500-1800μM的亚油酸或浓度为100-150μM的花生四烯酸组合的、浓度为0.0001-0.0009μM的前列腺素E2。
3.权利要求1至2中一项或多项的方法，其中所述培养基包含脂质或脂质代谢产物或其衍生物和/或前体中的三种。
4.权利要求1-3中一项或多项的方法，其中所述细胞培养是分批、补料分批或灌注细胞培养，优选地其中将在第2天时的细胞培养改变为灌注细胞培养，更优选其中在灌注已起始之后，灌注速率增加，甚至更优选其中所述灌注速率从小于或等于0.5个容器体积/天增加到5个容器体积/天，或者从小于或等于0.5个容器体积/天增加到2个容器体积/天。
5.权利要求1-4中一项或多项的方法，其中所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Jurkat细胞、293细胞、HeLa细胞、CV-1细胞或3T3细胞、或这些细胞中任一种的衍生物，其中所述CHO细胞可以进一步选自CHO-DG44细胞、CHO-K1细胞、CHODXB11细胞、CHO-S细胞和CHOGS缺陷细胞或其突变体。。
6.权利要求1-5中一项或多项的方法，其中所述异源蛋白质是治疗性蛋白质、抗体或其治疗有效片段，优选地其中所述抗体是单克隆抗体或其片段或双特异性抗体。
7.权利要求1至6中一项或多项的方法，其中所述脂质或脂质代谢产物或其组合导致生长抑制和/或增加的生产率，优选地
(a)其中相对于不包括脂质或脂质代谢产物的对照细胞培养中的总生产水平，由所述细胞培养产生的异源蛋白质的总生产增加至少5-50％，和/或<...
【专利技术属性】
技术研发人员：H·林，S·王，郑黎黎，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰国际公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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