利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法技术

本发明专利技术属于中药材来源品种鉴定技术领域，涉及利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法。采用本发明专利技术，当供试品为金银花或山银花中的一种或两种时，通过高效液相色谱检测供试品干燥品中断马钱子酸和绿原酸的重量百分比，并计算绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值；通过液质联用色谱检测供试品干燥品中川续断皂苷乙的重量百分比；利用绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值和川续断皂苷乙的重量百分比来鉴别金银花。本发明专利技术不受供试品性状限制，可用于金银花、山银花单一药材或两者混合物的鉴别，也可用于中成药中金银花、山银花单一药材或两者混合物的鉴别，有效提高鉴别准确度，为药品生产、流通、使用过程提供了鉴别真假的依据。

Identification of honeysuckle and Honeysuckle by HPLC and LC-MS

【技术实现步骤摘要】
利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法
本专利技术属于中药材来源品种鉴定
，涉及一种鉴别金银花和山银花的方法，具体涉及利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法。
技术介绍
金银花和山银花自2005版《中华人民共和国药典》起分列为两种药材。由于二者原植物种属相近、药材外观形态相似，难以区分，因此市场上金银花和山银花药材来源不清、品种混乱，因为山银花产量大，价格低，市场上经常存在山银花冒充金银花现象，然而两者的物质基础相差较大，从而直接影响到药材及其制剂的疗效，更严重的是山银花中皂苷含量比金银花多，而皂苷可以导致注射剂的溶血现象，直接危害用药者的生命安全。现有的用于金银花与山银花两者之间的品种鉴别方法均存在一些不足之处。如传统的外观形态鉴别依赖经验、主观性大，尤其是对于市场上两者混合品或粉碎状态无法鉴别；DNA分子鉴定法技术复杂、环境为万级实验，要求高，成本高，检验周期长，影响因素多导致重复性差。药理法验证成本高、周期长、影响因素多导致误差大，这些方法虽然可以在一定程度上对近缘品种进行区分，但无法对药效的优劣进行评价。尤其是上述几种方法对于粉碎状态的混合物或者中成药中掺伪现象无法鉴别。专利CN103173532B(一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用)涉及一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用。本方法包括PCR扩增ITS2核苷酸序列，包括1)提取样品DNA；2)PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列的片段；3)对扩增产物进行拼接，获得完整ITS2基因间隔区；4)构建样品的ITS2序列的NJ树。专利CN104419754A(一种快速鉴别金银花真伪的方法)公开了一种鉴别金银花及其常见伪品山银花的方法，是利用高分辨率溶解曲线技术对金银花与山银花的标志性核酸位点进行分析。本方法通过对供试金银花样品进行DNA提取、PCR扩增和HRM分析，确认标志性核酸位点分型，进而对金银花真伪进行鉴定。上述方法属于DNA分子鉴定法、需要PCR扩增，技术复杂，成本高。专利CN105277721B(一种鉴别口炎清制剂原料山银花和金银花的方法)公开了一种区分金银花和山银花的鉴别方法，包括以下步骤：以山银花或含山银花原料的制剂为对照；构建急性口腔炎症模型；通过比较供试品和对照标准品对急性口腔炎症模型细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表达水平的影响，鉴别区分金银花和山银花或其复方制剂。本方法需要山银花或含山银花原料的制剂为对照，构建急性口腔炎症模型；存在检验方法复杂、检验不够快速、成本高、影响因素多、误差大的缺陷。虽然现有技术中有以绿原酸与断马钱子酸的含量比值或川续断皂苷乙含量的单一指标作为鉴别依据的报道，但是其应用前提必须是性状观察样品是单一药材饮片时才可以应用，对于混合药材或者不能观察性状的药材鉴别受限。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法。本方法以绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值以及川续断皂苷乙的重量百分比为指标，采用高效液相色谱和液质联用色谱进行检测金银花及山银花干燥品中绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值以及川续断皂苷乙的重量百分比，来鉴别金银花和山银花。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法，当供试品为金银花或山银花中的一种或两种时，通过高效液相色谱检测供试品干燥品中断马钱子酸和绿原酸的重量百分比，并计算绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值；通过液质联用色谱检测供试品干燥品中川续断皂苷乙的重量百分比。利用绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值和川续断皂苷乙的重量百分比来鉴别金银花和山银花。当供试品干燥品中绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值小于2，且川续断皂苷乙的重量百分比为0时，判定为金银花。所述绿原酸与断马钱子酸的含量的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，于210～360nm波长处测定峰面积，采用外标法或标准曲线法计算，得到供试品中绿原酸与断马钱子酸的重量百分比，然后计算两者比值；所述川续断皂苷乙的含量的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入液质联用色谱仪，利用液相分离，质谱测定特征离子的面积，采用外标法或标准曲线法计算，得到供试品中川续断皂苷乙的重量百分比。优选的，(1)所述高效液相色谱法的测定条件为：色谱柱C18，4.6mm×250mm，5μm；断马钱子酸波长240nm，绿原酸波长324nm；以乙腈为流动相A，以pH值为2.5的酸的水溶液为流动相B，采用梯度洗脱，其中流动相A0～20min，体积百分比5％→15％；20～30min，体积百分比15％→28％；其余为流动相B。(2)所述液质联用色谱法的测定条件为：液相部分色谱柱：C18色谱柱，10mm×2.1mm，1.7μm；柱温：45℃；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；流动相：以0.1％甲酸(含10mmol/L甲酸铵)溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，其中流动相A0～3min，体积百分比92％，3～5min，体积百分比92％→35％，5～8min，体积百分比35％→15％，8～10min，体积百分比15％；其余为流动相B；质谱离子源模式：电喷雾(ESI)离子源；扫描模式：选择离子检测(SRM)；电离电压：3500V；雾化室温度：200℃；鞘气：高纯氮气，35L/min；辅助气：高纯氮气，10L/min；离子传输管温度：290℃；碰撞气：高纯氩气；采用负离子采集川续断皂苷乙，其质荷比母离子为1075.0，子离子为749.2，碰撞能量，40eV。所述的酸为磷酸或甲酸或乙酸或磷酸盐。进一步的，(1)所述绿原酸与断马钱子酸的含量的检测方法中的供试品溶液的制备方法为：取供试品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂10-50mL，超声处理15-60分钟，摇匀，过滤，即得。(2)所述川续断皂苷乙的含量的检测方法中的供试品溶液的制备方法为：取供试品，粉碎成细粉，取约0.25g，精密称定，置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇20-50mL，精密称重，室温下超声提取30min，冷却后，精密称重，用85％甲醇补足重量，滤过，取续滤液用0.22μm滤膜过滤，即得。所述85％甲醇是指甲醇与超纯水的混合液，甲醇的体积百分比为85％。所述超声的功率为250W，频率35kHz。所述溶剂为水或0-50％乙醇溶液或0-50％甲醇溶液或其混合物，其中0-50％乙醇/甲醇溶液是指乙醇/甲醇与超纯水的混合液，其中的百分比体积百分比。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术通过利用高效液相色谱检测供试品干燥品中绿原酸和断马钱子酸的重量百分比并计算其比值，利用液质联用色谱检测川续断皂苷乙的重量百分比，采用绿原酸和断马钱子酸的百分比的比值和川续断皂苷乙的重量百分比两项指标鉴别供试品，能有效的提高鉴别的准确度。(2)以绿原酸与断马钱子酸的含量比值及川续本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法，其特征在于，当供试品为金银花或山银花中的一种或两种时，通过高效液相色谱检测供试品干燥品中断马钱子酸和绿原酸的重量百分比，并计算绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值；通过液质联用色谱检测供试品干燥品中川续断皂苷乙的重量百分比；利用绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值和川续断皂苷乙的重量百分比来鉴别金银花中是否混入山银花。/n

【技术特征摘要】
1.利用高效液相色谱和液质联用色谱鉴别金银花和山银花的方法，其特征在于，当供试品为金银花或山银花中的一种或两种时，通过高效液相色谱检测供试品干燥品中断马钱子酸和绿原酸的重量百分比，并计算绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值；通过液质联用色谱检测供试品干燥品中川续断皂苷乙的重量百分比；利用绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值和川续断皂苷乙的重量百分比来鉴别金银花中是否混入山银花。


2.根据权利要求1所述的鉴别金银花和山银花的方法，其特征在于，当供试品干燥品中绿原酸与断马钱子酸重量百分比的比值小于2，且川续断皂苷乙的重量百分比为0时，判定为金银花。


3.根据权利要求1或2所述的鉴别金银花和山银花的方法，其特征在于，所述绿原酸与断马钱子酸的含量的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，于210～360nm波长处测定峰面积，采用外标法或标准曲线法计算，得到供试品中绿原酸与断马钱子酸的重量百分比，然后计算两者比值；所述川续断皂苷乙的含量的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入液质联用色谱仪，利用液相分离，质谱测定特征离子的面积，采用外标法或标准曲线法计算，得到供试品中川续断皂苷乙的重量百分比。


4.根据权利要求3所述的鉴别金银花和山银花的方法，其特征在于，
(1)所述高效液相色谱法的测定条件为：色谱柱C18，4.6mm×250mm，5μm；波长240-324nm；以乙腈为流动相A，以pH值为1.5～4的酸的水溶液为流动相B，采用梯度洗脱，其中流动相A0～20min，体积百分比5％→15％；20～30min，体积百分比15％→28％；其余为流动相B；
(2)所述液质联用色谱法的测定条件为：液相部分色谱柱：C18色谱柱，10mm×2.1mm，1.7μm；柱温：45℃；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL；流动相：以0.1％甲酸(含10mmol/L甲酸铵)溶液为流动...

【专利技术属性】
技术研发人员：张芳，张永清，郑冰清，张龙霏，石鹏亮，于晓，徐文流，翁少全，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东;37